如何设计一套高效的Co‑IP实验方案？

共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co‑IP）是研究蛋白质–蛋白质相互作用的经典方法，广泛应用于信号通路解析、靶点验证及药物机制研究中。通过特异性抗体富集目标蛋白及其复合物，再结合Western blot或质谱技术进行检测，Co-IP能够有效捕捉细胞内天然状态下的蛋白互作。原理相对简单，Co-IP实验对操作细节要求极高，稍有不慎便可能导致高背景、低重复性甚至假阳性。如何设计一套高效、可靠、具有可重复性的Co‑IP实验方案，成为科研人员在开展蛋白互作研究时必须重视的核心问题。

明确Co-IP实验目标：验证、筛选还是定量？

在设计Co-IP实验前，首要任务是明确实验目的。若目的是验证已知的蛋白互作关系，重点应放在抗体特异性和洗涤条件的优化上，确保结果的特异性和可信度。而如果目标是筛选未知的互作蛋白，则需构建更中性、温和的裂解体系，zuì大限度保留天然蛋白复合物，并配合后续质谱鉴定以获取全面互作谱。

当研究重点转向不同处理条件下互作强度的比较，例如药物处理前后蛋白互作网络的变化，则应引入稳定表达系统，并结合定量蛋白组学策略，如TMT或Label-free定量方法，确保数据的可比性与可信度。

Co‑IP实验关键环节与设计要点

1、样本制备：选择合适的裂解条件

Co-IP实验依赖于天然状态下的蛋白互作，裂解液的选择尤为重要。常用的非变性裂解液包括NP-40缓冲液和RIPA缓冲液，前者适用于胞浆或胞膜蛋白的互作检测，后者则适用于较为稳定的复合物体系。在裂解过程中应注意：

• 避免使用强变性剂如SDS和高浓度尿素，以防破坏蛋白复合物

• 全程在4°C下操作，抑制蛋白降解与复合物解离

• 加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，保持蛋白活性及修饰状态

• 建议采用温和震荡裂解，避免超声处理造成复合物破坏

2、抗体选择与交联处理：提升特异性，减少干扰

抗体的选择直接决定Co-IP的特异性和背景水平。优选亲和纯化后的单克隆抗体，其特异性和重复性通常优于多克隆抗体。在磁珠选择上，Protein A或G偶联的磁珠为主流选择，根据抗体亚型进行匹配。为减少重链干扰Western blot或质谱检测，建议将抗体通过交联剂（如DSS、BS3）固定到磁珠上，可有效避免抗体轻重链在洗脱蛋白中释放，影响结果判读。

3、抗原抗体孵育：确保结合充分，降低背景

目标蛋白与抗体之间的结合效率影响免疫复合物的富集效率。通常建议使用500–1000 μg的总蛋白进行免疫沉淀，孵育时间为2–4小时或过夜（4°C条件下轻柔摇晃）。缓冲体系应维持中性pH与等渗状态，可加入0.1–0.5% NP-40抑制非特异吸附。为获得高重复性，建议设立输入对照、IgG阴性对照及已知互作蛋白阳性对照。

4、洗涤步骤：去除非特异结合，保留真实互作

洗涤过程既要有效清除非特异性蛋白，又需保留真实的弱互作复合物。一般建议洗涤3–5次，每次使用缓冲液进行轻柔混匀。

• 背景低时可使用PBS或TBS简单洗涤

• 存在较高背景时可加入0.1–0.5% NP-40

• 如需清除强吸附性杂蛋白，可短暂使用高盐缓冲液（如300–500 mM NaCl），但应注意可能对弱互作的影响

适当的洗涤策略应通过预实验确定，以兼顾灵敏度与特异性。

5、洗脱与检测：选择合适检测手段

蛋白洗脱后，可通过两种方式进行下游分析：

• Western blot：用于验证特定互作关系，适合目标明确的验证型实验，例如HA-tag pull-down后检测Myc-tag蛋白

• LC-MS/MS质谱：适用于大规模筛选未知互作蛋白群体，能够提供全面互作谱与半定量信息

在洗脱方式上，可选择低pH洗脱、SDS样品缓冲液煮沸，或非变性洗脱缓冲液，需根据后续应用需求合理选择。

常见问题解析与优化建议

在Co-IP实验中，研究者常常会遇到信号弱、背景高或重复性差等问题，以下是部分典型问题及其优化策略：

1、若无互作信号，可能因目标蛋白表达量低、抗体亲和力不足或复合物在裂解过程中解离。此时应优化裂解条件、增加样本量，或引入交联策略增强复合物稳定性。

2、背景信号过高通常源于非特异结合或抗体质量不佳，建议更换抗体、提高洗涤强度，并在孵育缓冲液中加入封闭剂（如BSA）抑制非特异吸附。

3、重复性差则多与样本处理流程不一致有关，建议标准化裂解与孵育流程，并在每批实验中设立一致的对照组。

4、抗体重链干扰Western blot或质谱结果，可通过交联抗体或选择避miǎnjiǎn测IgG位点的抗体标签策略加以规避。

高质量的Co‑IP实验不仅依赖于优质的抗体与合理的实验设计，更需要研究者对每一个细节保持足够的敏感度与执行力。从裂解液配方、抗体筛选，到洗涤与检测方法的匹配，都是实现可靠蛋白互作研究的关键步骤。百泰派克生物科技依托先进的蛋白组学平台、丰富的样本处理经验以及灵活的定制化技术服务，已为众多课题组和企业研发团队提供高质量的蛋白互作研究支持。

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百泰派克生物科技特色项目

蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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