基于Co‑IP的免疫信号通路分析方法

在生命科学研究中，免疫信号通路是维持机体免疫稳态、应对外来病原挑战的关键生物学系统。这些通路由一系列受体识别、信号转导和效应分子激活步骤构成，广泛参与炎症反应、抗病毒免疫、自身免疫等过程。深入解析免疫通路中蛋白之间的动态互作关系，对于理解疾病机制、发现新型免疫调节靶点具有重要意义。在众多蛋白互作研究技术中，共免疫沉淀（Co‑immunoprecipitation，Co‑IP）凭借其高特异性与较强的原位保真性，成为研究免疫信号通路的常用手段。结合高分辨率质谱（Mass Spectrometry, MS）技术，Co‑IP不再局限于验证性互作检测，而是发展为一种强大的互作组学研究平台。

一、共免疫沉淀（Co‑IP）技术概述

Co‑IP是一种基于抗体特异识别能力的蛋白互作富集方法，能够从复杂细胞裂解液中选择性地捕获靶蛋白及其结合蛋白，常用于验证蛋白间直接或间接互作关系。

Co‑IP的优势包括：

（1）原位互作捕获：可保留生理条件下的蛋白复合体结构；

（2）操作简便：适用于内源性蛋白或过表达系统；

（3）与多种下游分析兼容：特别适合与质谱联用进行高通量识别。

在免疫信号研究中，许多信号复合物具有瞬时性、可逆性特征（如TCR信号簇、NF-κB活化复合体），对实验条件极为敏感，Co‑IP因其温和裂解+特异富集的特性成为shǒuxuǎn方法，为深入开展免疫信号通路分析奠定基础。

二、免疫信号通路中的蛋白互作网络解析

免疫信号通路的信号转导往往通过蛋白复合体的组装和重构来完成。例如：

（1）Toll样受体（TLR）通路中，配体结合后诱导MyD88、TRAF6、IRAK1等形成多蛋白信号平台；

（2）JAK-STAT通路则通过配体介导受体构象变化后激活JAK，并磷酸化STAT形成功能复合物；

（3）TCR/BCR信号涉及多个激酶、衔接蛋白（如ZAP70、LAT、SLP-76）之间的动态互作。

这些互作不仅调控信号强度和持续时间，还决定下游效应（如细胞因子产生、细胞增殖、程序性死亡等）的具体走向。系统解析免疫通路中蛋白互作网络结构及其变化规律，是理解免疫信号调控机制的关键。

三、Co‑IP + 质谱联用：实现互作网络的全面解析

Co‑IP多用于“点对点”的互作验证，如WB检测单一结合蛋白。但结合质谱技术后，Co‑IP可以扩展为互作组学（Interactomics）平台，系统捕获并定量分析靶蛋白的完整互作网络，是推动免疫信号通路分析系统化研究的核心方法之一。

标准Co‑IP-MS流程包括：

1、实验设计

（1）选择研究靶点（如TIRAP、STAT1、ZAP-70等）

（2）设定对照组（IgG、未刺激组）

（3）优化刺激条件与时间点（模拟免疫激活过程）

2、蛋白互作富集

（1）使用特异抗体或标签系统（如Flag、HA）

（2）采用温和裂解液保留天然复合物结构

（3）多次洗涤去除非特异结合

3、酶解与质谱分析

（1）富集产物经胰蛋白酶酶解

（2）使用高分辨质谱仪器（如Orbitrap Fusion Lumos）进行LC-MS/MS分析

4、数据分析与解读

（1）使用MaxQuant、Spectronaut等软件识别与定量互作蛋白

（2）蛋白注释与功能富集分析（GO、KEGG）

（3）构建互作网络图，识别关键调控节点

通过该方法，研究人员可获得包括直接与间接结合蛋白、动态变化趋势、功能通路富集等在内的全面数据，为深入理解免疫调控机制和开展免疫信号通路分析提供系统支持。

四、关键技术要点与优化建议

Co‑IP-MS技术强大，但其可靠性高度依赖于实验设计和质量控制。以下为常见难点与优化建议：

1、抗体选择与验证

（1）优选高亲和力、低背景的单抗

（2）如使用标签蛋白（Flag/HA/Myc），需验证表达水平与标签暴露性

（3）建议进行小规模预实验确认免疫沉淀效果

2、对照组设计

（1）设置IgG对照以识别非特异结合蛋白

（2）输入样品作为蛋白表达参考

（3）多重复样保证统计可靠性

3、背景蛋白剔除

（1）使用CRAPome数据库去除常见污染物

（2）强化洗涤步骤，降低非特异结合

（3）多条件联合筛选高置信互作对

4、数据解释与验证

（1）避免仅依赖质谱结果，关键互作需通过WB、RNAi敲除或共定位进一步验证

（2）结合生物学背景与通路数据库进行功能推断，增强结果生物学解释力

免疫系统的复杂性不仅在于通路数量众多、调控层级复杂，更在于其高度动态、上下游交织的信号传导模式。Co‑IP-MS技术为研究者提供了一种jīngzhǔn、系统的视角，解析这些精细调控过程背后的蛋白互作逻辑。随着质谱灵敏度与数据分析能力不断提升，基于Co‑IP的互作组学将在未来免疫信号通路分析、疾病机制解析及免疫靶点开发中扮演愈发重要的角色。如您希望深入探索免疫通路的蛋白互作网络，欢迎联系百泰派克生物科技，我们将以zhuānyè技术与定制化方案，助力您的科研突破。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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