如何让低表达蛋白成功进行Co‑IP？

在生命科学研究中，蛋白互作的jīngzhǔn识别对于揭示细胞信号通路、疾病机制及药物靶点具有重要意义。免疫共沉淀（Co‑IP）作为经典的互作捕获技术，广泛应用于各类生物样本中。低表达蛋白的Co‑IP实验由于信号微弱、背景干扰严重，常常成为研究者的“卡点”。如何在保持互作真实性的前提下，有效富集并鉴定低丰度目标蛋白，成为提高实验成功率的关键。

一、低表达蛋白Co‑IP的核心挑战

Co‑IP的原理是利用抗体捕获目标蛋白及其互作复合物，但当目标蛋白丰度过低时，会面临：

• 抗体无法有效识别：低表达意味着抗原量少，普通抗体易失效

• 非特异性结合比例高：背景蛋白占据大量结合位点

• 信噪比低：质谱检测难以区分真实互作与背景噪声

• 目标蛋白沉淀效率低：影响互作蛋白的富集效果

二、如何提高低表达蛋白的Co‑IP成功率？

1、优化细胞或组织来源：从源头提升目标蛋白丰度

（1）选择高表达背景：优先使用天然表达量相对较高的细胞系或组织；

（2）诱导表达：通过药物处理（如IFN-γ、TNF-α）上调目标蛋白表达；

（3）低水平过表达：使用低拷贝表达系统，避免扰动互作网络；

（4）时空表达调控：利用CRISPRa或Tet-on系统精细控制表达水平。

2、抗体是关键：选择高亲和力、高专一性抗体

（1）优选单克隆抗体：特异性好，重复性高；

（2）验证抗体性能：通过Western blot确认其识别低丰度蛋白的能力；

（3）亲和纯化抗体（affinity-purified）：降低背景噪声；

（4）标记抗体使用（如biotin化）：利于后续富集和洗脱。

3、蛋白裂解与保存：保证互作复合物的完整性

（1）使用温和裂解液（如NP-40, digitonin）：避免破坏蛋白复合物；

（2）添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂：防止降解和修饰干扰；

（3）快速操作 & 低温处理：避免蛋白结构变化；

（4）交联固定（可选）：适用于转瞬即逝的弱互作（如使用DSS, formaldehyde）；

4、改进免疫沉淀步骤：提高特异性和富集效率

（1）磁珠优于琼脂糖珠：结合效率高，洗涤更彻底；

（2）预清除处理：先用非特异IgG去除背景结合；

（3）串联IP（Sequential Co‑IP）：先拉下目标蛋白，再进行二次IP增强特异性；

（4）交联抗体到磁珠：防止重链/轻链干扰下游质谱分析。

5、洗涤和洗脱：兼顾保留互作与去除背景

（1）优化洗涤盐浓度和剂量：增强选择性；

（2）分步洗脱：区分强互作与弱互作蛋白；

（3）Gentle elution buffers：如甘油酸盐缓冲液，保留蛋白构象。

三、Co‑IP与质谱联用：低表达蛋白互作研究的“放大镜”

低表达蛋白的互作研究，zuì终常常依赖高灵敏度质谱分析。SDS-PAGE + 银染 + 质谱路径，已难以满足低丰度需求。

1、高灵敏质谱仪是保障

（1）Orbitrap Exploris 480 / timsTOF Pro 2 等高分辨率质谱仪器，可以识别fg级别的蛋白；

（2）DIA-MS技术（数据独立采集）进一步提升数据深度与重现性。

2、丰度增强策略

（1）低背景磁珠体系：如SureBeads、Dynabeads等；

（2）强富集弱洗脱：通过交联抗体及改良洗脱缓冲液组合优化；

（3）采用纳流LC-MS：提高灵敏度和分离度。

3、数据分析策略

（1）背景数据库过滤（如CRAPome）；

（2）统计学富集分析（如SAINT）；

（3）互作网络可视化（如Cytoscape）辅助解释生物学意义。

低表达蛋白的Co‑IP实验，虽具挑战，却也是突破科研瓶颈、挖掘关键调控网络的重要一步。通过科学合理的实验优化、高质量抗体选择与先进质谱平台的联合应用，可以显著提升蛋白互作检测的深度与准确性。百泰派克生物科技依托丰富的互作组学经验与标准化服务流程，助力您在低丰度蛋白的Co‑IP或互作组学研究，欢迎随时联系我们。百泰派克生物科技将为您提供从实验设计到数据解读的全流程支持，助力您的科研工作事半功倍。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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