利用Shotgun蛋白质组学进行膜蛋白鉴定

膜蛋白（membrane proteins）广泛分布于细胞内外膜系统，在信号转导、物质运输、细胞识别等过程中发挥关键作用。膜蛋白仅占人类基因组编码蛋白的约30%，却是药物作用靶点的60%以上。由于其疏水性强、易聚集、提取困难等特点，膜蛋白始终是蛋白质组学研究中的“硬骨头”。在众多蛋白质组学技术中，Shotgun蛋白质组学（也称为bottom-up蛋白质组学）凭借其高通量和高覆盖率的优势，成为膜蛋白研究的重要工具。

一、Shotgun蛋白质组学原理简述

Shotgun蛋白质组学是一种先酶解、后分离鉴定的策略。具体流程包括蛋白提取、酶解、肽段分离（如LC）、质谱检测（MS/MS），再通过数据库比对进行蛋白鉴定。该技术可广泛用于复杂样本中蛋白质的全面解析，尤其适合高通量、高复杂度的蛋白质组学研究。

相较于传统的2D凝胶方法，Shotgun策略避免了对难溶蛋白的分离限制，更适合处理如膜蛋白这类难溶组分。

二、膜蛋白的质谱鉴定难点

膜蛋白的结构特性导致其在传统质谱流程中面临多个技术挑战：

1、疏水性强，提取难度大

膜蛋白嵌入脂双层，需使用去污剂（detergents）或有机溶剂提取，但这些试剂可能干扰后续质谱分析。

2、酶解效率低

膜蛋白的跨膜结构阻碍酶切位点暴露，导致酶解不完全，影响肽段的产生和鉴定。

3、富含低丰度蛋白

膜蛋白常常是低丰度存在，在总蛋白中占比不高，容易被高丰度可溶性蛋白信号掩盖。

4、数据库检索复杂

跨膜区的肽段特征不明显，容易导致数据库匹配失败或假阳性增加。

三、解决方案：优化Shotgun流程以增强膜蛋白覆盖率

为了克服上述难点，科研人员开发出一整套专门针对膜蛋白的优化方案：

1、膜蛋白提取策略：温和高效、兼顾MS兼容性

高效提取膜蛋白是成功鉴定的关键。常用方法包括：

• SDS与有机溶剂协同提取：如使用0.1% SDS联合异丙醇等有机相，提高疏水蛋白溶解性。

• 去污剂替代方案：如RapiGest、Sodium deoxycholate（SDC）等质谱兼容性强的试剂，兼顾提取效率与下游兼容性。

• 膜蛋白富集：通过超速离心或柱层析预富集膜组分，提升低丰度膜蛋白的检测概率。

在百泰派克生物科技，我们构建了基于SDC+超速离心的膜蛋白提取平台，显著提高了蛋白得率与重复性。

2、蛋白酶选择与双酶切策略

传统的Trypsin在处理跨膜结构时效率有限，常引入其他蛋白酶辅助，如：

• Lys-C：能耐高变性环境，适合前处理后先行切割；

• Chymotrypsin、Glu-C：提供不同的切割模式，提高肽段多样性；

双酶切策略不仅提升酶解效率，也有助于跨膜区肽段的生成，从而提高数据库匹配率。

3、多维分离系统提高检测深度

膜蛋白肽段常富含疏水残基，传统的反相LC对其保留不佳。改进策略包括：

• 高pH反相分级（HpH-RP）

• 强阳离子交换（SCX）

• 中性/亲水相互作用色谱（HILIC）

多维分离不仅提升复杂度样本的覆盖率，也有助于稀有膜蛋白的深入鉴定。

四、质谱平台选择与数据分析优化

1、高分辨质谱平台：提升鉴定灵敏度与精度

Orbitrap、TIMS-TOF等高分辨率质谱仪为膜蛋白的准确鉴定提供了保障。尤其是在进行Label-free或TMT定量时，质量精度直接影响肽段定量的可信度。

2、数据库构建与专用搜索策略

• 选择性数据库：建议使用Uniprot中经注释的“membrane protein”子集，减少搜索背景。

• 预测跨膜区肽段：结合TMHMM等工具预测跨膜区域，提高识别的生物学可信度。

• 开放式搜索：识别翻译后修饰（如糖基化、脂化），这些修饰常与膜蛋白功能密切相关。

五、百泰派克生物科技的zhuānyè膜蛋白质谱服务

百泰派克生物科技专注于高难度蛋白组学项目的技术攻关，我们在膜蛋白研究领域提供以下一体化服务：

1、高效膜蛋白提取与富集方案（兼容组织、细胞、外泌体等多种样本）；

2、双酶切与多维分离结合，提升鉴定深度；

3、Orbitrap Exploris 480与TIMS-TOF双平台支持，确保数据质量；

4、提供从样本处理、质谱分析到生物信息学解读的全流程服务。

随着质谱技术与蛋白质组学方法的不断进步，膜蛋白这一“暗物质”领域正在被逐步揭示。Shotgun蛋白质组学为膜蛋白的高通量、系统性研究提供了强大支持。通过优化样本处理流程、采用先进质谱平台、结合智能化数据分析，研究者将能更全面地理解膜蛋白在生命过程中的作用。在百泰派克生物科技，我们始终致力于将技术转化为成果，助力您的每一次科学探索。如您对膜蛋白质谱分析、靶点筛选或科研合作有进一步兴趣，欢迎联系我们的技术团队获取免费方案咨询与文献推荐。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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