四种色谱分离技术

色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，Z_U_I终达到分离的效果。

色谱类型

根据分离机理的不同，色谱可分为五种类型：吸附、分布、交换、排阻和亲和。色谱分离方法包括吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱、亲和色谱和尺寸排阻色谱。

色谱的物理化学原理（Broekaert J etal.,2015）

几种色谱分离技术的比较

亲和色谱

亲和色谱是色谱分离技术的一个重要分支。它是一种液相色谱方法，利用固定相的结合特性吸附目标产物并实现分离和纯化。例如，酶和基质（或抑制剂）、抗原和抗体、激素和受体、外源凝集素和核酸碱基对等之间的特异相互作用，等可形成一种具有不溶性载体的相互作用物质，均可用作色谱固定相。可以从复杂的混合物中可逆地拦截另一方，以达到纯化的目的。亲和层析已广泛应用于生物分子的分离和纯化，是分离纯化结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸、多糖等生物大分子的重要方法之一。

用于蛋白质纯化的亲和色谱的平衡（1），吸附/洗涤（2）和解吸附（3）步骤的示意图（Luana et al.,2012）

尺寸排阻色谱

尺寸排阻色谱（SEC）也称为凝胶色谱，利用分子筛使大小和数量不同的分子，根据各组分的排阻能力不同完成组分的分离。小分子量化合物可进入孔中并具有较长的停留时间，而大分子量化合物被阻止进入孔中，继续随流动相流动。当洗脱液为水溶液或缓冲液时，称为凝胶过滤色谱（GFC），在生物学领域应用广泛；当使用有机溶剂作为洗脱液时，称为凝胶渗透色谱（GPC），被广泛用于高分子领域。尺寸排阻色谱通常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质和核酸。

凝胶过滤色谱基于蛋白质分子量或分子形状的差异对样品进行分离。当样品从色谱柱顶部向下移动时，大的蛋白质分子无法进入凝胶颗粒并被快速洗脱；而较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒，并且较小的蛋白质进入凝胶的保留时间不同。分子量越大，洗脱时间越早，从而使具有不同分子大小的蛋白质被分离。

键合相色谱

根据分离组分在流动相和固定相中的溶解度不同，对样品进行分离。该方法使用一种特殊的液体物质涂覆载体表面，或与载体表面化学键合以形成固定相。涂覆固定（第一种操作方法）现在很少使用，化学键合固定相如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱，在工业上Z_U_I常用。根据固定相和流动相的类型，液相色谱可分为正相色谱（NPC）和反相色谱（RPC）。随着柱填料的快速发展，反相色谱的应用范围逐渐扩大，现已应用于分析一些非极性样品或易分离的样品。

吸附色谱

吸附色谱法使用固体吸附剂分离混合物中的组分，常用的吸附剂是硅胶或氧化铝。该方法基于固定的相对组分吸附力的大小来分离各组分。整个过程取决于吸附-解吸的平衡。这种分离方法适用于分离分子量为200-1000的异构体以及非离子化合物。局限性是离子化合物的分离容易拖尾。

参考文献

1-. Kecskemeti A, Gaspar A. Particle-based liquidchromatographic separations in microfluidic devices - A review.Analytica Chimica Acta, 2018.

2. Broekaert, J.A.C. Daniel C. Harris. Quantitative chemicalanalysis, 9th ed. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015(407): 8943–8944.

3. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, Andréa Santos,Maria T.S. Correia, et al. Protein Purification by AffinityChromatography, Intech Open, 2012.

4. Wong, Min-Liang. Shirts off to boost separation methods.Nature, 2017, 543(7646):491-491.

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