随着高分辨率质谱仪分析技术的发展,蛋白质质谱鉴定的方法已经相当纯熟,一次性鉴定多个蛋白样品,以及低丰度蛋白样品已经不再是难事。但是因为质谱的灵敏度高,外来引入的蛋白质可能会造成质谱鉴定的假阳性,因此,在蛋白样品的准备过程中要注意避免引入外来蛋白污染物。另外,蛋白样品的准备也需要使用与质谱仪检测兼容的溶液和试剂,这样可以极大提高质谱仪鉴定的准确度。在这期小编就来给大家介绍蛋白质质谱鉴定前的样品准备注意事项。
1-. 蛋白质样品制备和质谱鉴定流程
蛋白质质谱分析一般流程
蛋白质质谱鉴定的一般流程
1-. 首先对细胞或组织样品进行破碎,破碎的方法有很多种。大多数细胞可以通过选用常用的细胞裂解试剂,例如RIPAbuffer,添加蛋白酶抑制剂和还原剂,来裂解细胞。组织则可以通过低温匀浆,液氮冷冻研磨等方法破碎组织细胞。
2. 接着12,000 rpm,4度高速离心10分钟,去除不可溶的细胞组分
3. 液体蛋白样品可以使用抗体进行富集,提纯,以及IP处理,再浓缩待检测的蛋白;也可以使用1D/2D-PAGEgel分离蛋白。
4.浓缩后的液体蛋白经过酶切后,再使用LC-MS/MS分析;蛋白胶样则需要切下与目的蛋白分子量一致的蛋白条带,再对蛋白进行in-gel酶切和质谱检测分析。
5. 对质谱鉴定的数据进行分析获得可信度高的蛋白肽段序列,再与蛋白数据库进行比对获得蛋白质ID
2. 样品类型
细胞样品:动物细胞,植物细胞,真菌和细菌等微生物细胞
组织样品:动物组织,植物组织
体液样品:血清、血浆、尿液等
3. 样品用量
4. 注意事项
4.1. 浓缩样品:
蛋白质样品可以用沉淀,膜分离,分离柱,冷冻干燥等各种方式进行浓缩,用户应根据样品的特点选择合适的方法共列,用SDS样品液可以从色谱样上中洗脱蛋白,从而保持样本体积小。
4.2. 电泳凝胶:
对于SDS- PAGE,传统的Laemmli式,三甘氨酸凝胶及其各种改进型的凝胶,如二,三凝胶或三盐酸凝胶,都可以兼容于蛋白质鉴定。各种凝胶浓度也没有限制。用户选择凝胶的类型和浓度液,应根据对样本的分离效果好来决定。
4.3. 蛋白胶染色:
• Coomassie Blue, SYPRO Ruby 以及Silver stain样品均可进行蛋白的鉴定试验;
• 银染的样品有可能与后续的质谱分析不兼容,我们推荐您使用下面的产品或者实验步骤进行银染实验:
ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)
Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)
• 另外,银染的样品请不要进行脱色处理
4.4. 液体样品:
样品准备过程中尽量减少SDS等表面活性剂的使用,并注意降低盐浓度。如果您提交IP洗脱样品,我们推荐使用HPH EB (0.5 MNH4OH, 0.5 mM EDTA) 缓冲体系进行last step蛋白的洗脱,保证洗脱缓冲体系与后续的质谱实验兼容。
4.5. 切割蛋白带:
凝胶在切割过程中应避免与手,灯箱,或任何其他可能的角蛋白污染源直接接触。在切割蛋白胶带适应尽量避免割下空白凝胶(它可能会降低酶切的消化效率和多肽的回收率)。将每个凝胶带置于干净的,1.5毫升的微型离心管并给每个样本小心地做上标签。
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