如何开展Shotgun蛋白组数据库搜索与FDR控制？

Shotgun蛋白组学实验中，质谱仪获取的仅是肽段碎片的m/z信号，这些数据本身无法直接告诉我们样本中有哪些蛋白质。真正实现蛋白鉴定的关键步骤是Shotgun蛋白组数据库搜索，即通过算法将质谱谱图与理论肽段进行比对，从而反推出原始蛋白组成。数据库匹配并非“juéduì正确”，由于谱图复杂性、测量误差及生物背景干扰，假阳性识别不可避免。实施有效的FDR控制（假发现率）成为蛋白质组学数据可信度的核心保障。

数据库搜索

1、数据库搜索的基本流程

Shotgun蛋白组数据库搜索通常包括以下步骤：

（1）将实验获得的MS/MS谱图（通常为.mgf、.raw或.mzML格式）输入至搜索引擎；

（2）根据设定的蛋白质数据库（如UniProt、人类参考蛋白数据库等），计算出理论肽段的碎裂谱图；

（3）将实验谱图与理论谱图逐一匹配，并打分（Score）；

（4）根据打分结果判定匹配的可靠性，输出候选肽段与蛋白质列表。

2、常用数据库搜索引擎

3、Shotgun蛋白组数据库搜索的选择原则

（1）推荐使用物种特异性数据库（如Human Uniprot FASTA），确保搜索效率；

（2）添加污染库（contaminant）以识别实验过程引入的常见背景（如胰蛋白酶、角蛋白）；

（3）进行反向或随机化数据库构建以支持FDR计算。

FDR控制

1、什么是假发现率（FDR）？

FDR（False Discovery Rate）指的是在被鉴定为“阳性”（即鉴定成功）的肽段或蛋白中，实际上为错误匹配的比例。举例说明：若鉴定出1000个肽段，FDR为1%，意味着可能有10个是假阳性。

2、为什么FDR控制至关重要？

（1）避免数据污染和过度解释；

（2）提高科研结果的可重复性与发表可信度；

（3）满足SCI期刊对质谱鉴定质量的评审要求。

3、如何实现FDR控制？

（1）Target-Decoy搜索策略（靶标-诱饵法）

这是目前zuì常用的FDR估算方法。

原理：

• 在数据库中人为加入“虚假”蛋白质序列（如将真实蛋白反向排列）作为诱饵（decoy）；

• 对实验数据进行“靶标+诱饵”数据库搜索；

• 假设诱饵序列被匹配的频率即为假阳性水平；

• 通过统计靶标与诱饵匹配的数量比来估算FDR。

实现工具：

• MaxQuant、Mascot、Proteome Discoverer等均自动内置此策略；

• 可设定1%、5%或更严格的FDR阈值（一般推荐<1%）。

（2）肽段层级 vs. 蛋白层级 FDR

FDR控制可在不同层级执行：

（3）打分策略与过滤标准

不同搜索引擎有不同的打分系统：

• Mascot：Ion Score、Expect值

• MaxQuant：Posterior Error Probability（PEP）、Score

• SEQUEST：Xcorr、DeltaCn值

建议结合多种打分指标设定过滤门槛，使用zuì低识别肽段数≥2作为蛋白鉴定标准，提升可靠性。

Shotgun蛋白组数据库搜索与FDR控制中的常见问题与优化建议

百泰派克生物科技在数据库搜索与FDR控制中的实践经验

百泰派克生物科技结合高分辨率质谱平台（如Orbitrap Exploris 480、timsTOF Pro 2），为客户提供标准化、可追溯的蛋白鉴定数据：

✅ 使用UniProt+Contaminant+Decoy构建三层级数据库，确保鉴定覆盖率与准确率并重；

✅ 默认执行PSM、Peptide、Protein三个层级的1% FDR控制，确保发表级别数据质量；

✅ 根据项目需求可进行开放搜索（Open Search）与翻译后修饰识别（PTM）；

✅ 提供详细的数据库匹配报告、FDR曲线图、蛋白组信息矩阵等生信结果。

Shotgun蛋白组数据库搜索是将质谱数据转化为科学的关键步骤，而FDR控制则是这一步的质量把关者。一个好的蛋白组实验不仅要“鉴定得多”，更要“鉴定得准”。百泰派克生物科技坚持数据驱动、质量优先的理念，从数据库构建、搜索参数优化到FDR分层控制，力求为每一位科研用户交付高可靠性、高可重复性、高发表价值的蛋白组数据。

百泰派克生物科技特色项目

蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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