如何选择合适的泛素化蛋白质富集策略？

泛素化（ubiquitination）作为一种关键的可逆蛋白质翻译后修饰，在细胞周期调控、蛋白质降解、DNA 损伤修复、信号转导等多条生命活动路径中发挥核心作用。研究泛素化的深度与精度，往往依赖高效且选择性强的富集策略。不同的实验目标、样本来源和研究深度，对富集方法的要求大相径庭。如何选择合适的泛素化蛋白质富集策略？这是科研人员在实验设计阶段必须解决的重要问题。合理的策略选择不仅关系到数据质量，更直接影响研究的效率与的可信度。

一、富集策略总览

1、通用抗泛素抗体法（Anti‑Ub Antibody Enrichment）

（1）原理与流程：通过泛素单抗（如 FK2、VU-1 或 P4D1）捕获泛素修饰蛋白，适用于泛素化蛋白全蛋白级别富集。

（2）优势：

① 通用性强，可覆盖多种泛素链类型

② 操作简便，与大多数实验室常规流程兼容

（3）局限：

① 抗体识别多泛素链类型，缺乏链型特异性

② 可能捕获大量非目标蛋白，导致质谱背景复杂

（4）应用场景：适合泛素化蛋白总量测定、泛泛搜索、筛选候选蛋白。

2、TUBEs（Tandem Ubiquitin Binding Entities）

（1）原理与流程：利用二价或更多泛素结合域串联提高对泛素链的亲和力，通常可捕获 K48、K63 链型。

（2）优势：

① 高亲和力，极大提升捕获效率

② 可富集特定泛素链型（如 K48 或 K63）

（3）局限：

① 结构相对复杂，价格偏高

② 需明确链型需求，不宜通用

（4）应用场景：适用于聚泛素链研究，如蛋白降解机制、信号转导路径。

3、修饰位点级别方法（K-ε-GG Remnant Enrichment）

（1）原理与流程：细胞裂解物经胰蛋白酶消化后，泛素残留 Gly–Gly（K-ε-GG）修饰的肽段捕获。使用专门对特定残基识别的抗体，直接富集泛素化位点。

（2）优势：

① jīngzhǔn定位泛素修饰位点

② 下游质谱搜索简化，信噪比高

（3）局限：

① 仅通用于胰蛋白酶

② 对泛素链顶端肽段或小肽缺乏覆盖

③ 实验耗时、抗体成本偏高

（4）应用场景：适合泛素位点组学、定量比较、修饰位点jīngquè研究。

4、流式多肽捕获（DiGly + TMT 或 TMTpro）

（1）原理与流程：在 K-ε-GG 富集基础上，结合TMT/TMTpro同位素标记进行多样本高通量对比。

（2）优势：

① 可在一个质谱实验中检测数十个样本

② 数据量大、定量jīngzhǔn

（3）局限：

① TMT标签昂贵，要求实验设计复杂

② 需高分辨质谱仪支持，如 Orbitrap Fusion Lumos

（4）应用场景：适合泛素组动态变化研究、药物干预、时间梯度实验。

二、影响选择的关键参数

1、研究目标：蛋白 vs 位点

（1）若只需识别泛素修饰蛋白名单 → 推荐抗泛素抗体法或 TUBEs

（2）若需jīngzhǔn定位泛素修饰位点 → K-ε-GG 富集是zuì优选择

2、泛素链型聚合结构

（1）K48 聚泛素链：蛋白质生物降解

（2）K63 链：信号传导、DNA 修复

TUBEs 可按链型选择，可有效富集目标链型蛋白。

3、定量需求与样本数

（1）对比组少（如 2~4 组）：推荐标签自由方法 + K-ε-GG 抗体（LFQ）

（2）多组（5 组以上）：推荐 TMT/TMTpro + K-ε-GG + 高通量 LC-MS/MS

4、样本类型与起始量

（1）细胞系/小动物组织（≤1 mg 蛋白）：TUBEs 或抗体法足矣

（2）大组织体积（≥10 mg 蛋白）：位点级别富集避免非特异捕获，建议 K-ε-GG 方法

5、实验室资源与预算

（1）抗体法与 TUBEs 基本工具费用不高（抗体成本占主）

（2）K-ε-GG 抗体 + TMT 材料成本高，但直接获取高质量位点数据，长远效果明显

（3）百泰派克可提供小批量试剂和定制试验方案，节省研发投入成本

三、性价比评价表

注：成本为典型实验估算，实际依赖于样本起始量、抗体/试剂品牌与实验规模。

四、实验流程一览（以 K-ε-GG 富集为例）

1、样本准备

（1）用 RIPA 或 SDSbased buffer 迅速裂解

（2）蛋白定量，推荐使用 BCA/Bradford 方法

2、蛋白质消化

（1）流程：还原 → 烷基化 → 胰蛋白酶 4–16 h 温箱消化

（2）可选 二次酶消化（LysC + Trypsin）改善覆盖度

3、预富集清理

（1）离子交换（SCX/SAX）或高 pH RP，分离干扰杂质

4、K-ε-GG 抗体富集

（1）冷链操作，4 °C 孵育 ≥1 h

（2）丢弃未结合物，洗脱后收集肽段

5、质谱分析

（1）纳升级 LCMS/MS，推荐使用高分辨仪如 Orbitrap Exploris/Fusion Lumos

（2）数据库搜索确保 FDR ≤ 1%（蛋白组 & 位点）

6、数据解析

（1）使用 MaxQuant、Proteome Discoverer + PTMProfiler、MSstats 等

（2）定量比较、GO 富集、泛素位点交互网络挖掘

五、选择合适的泛素化蛋白质富集策略原则：

1、明确研究目的：是蛋白层面还是位点层面？链型特异还是泛泛捕获？

2、评估成本预算与实验室资源：抗体法成本适中，SLiCE 可快速验证；TMT 适用于高通量多样本研究。

3、结合样本类型和起始量：小样本用高亲和 TUBEs，复杂样本推荐位点富集。

4、质量优先原则：若项目要求反复获得高覆盖/高准确度泛素位点数据，建议寻求zhuānyè平台（如百泰派克）协助。

若合理选择泛素化蛋白质富集方法，既能显著提高质谱覆盖率，也能帮助科研团队捕捉到关键泛素化位点。欢迎随时联系百泰派克。我们将结合您的项目背景，提供定制化实验设计并承担执行与数据解析，助力科研成果快速落地。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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