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DNA电泳技术原理

DNA电泳技术原理

根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显色。

琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，小型蛋白电泳槽，它们能以同样的速度向正极方向移动。

2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

3）溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。

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蛋白电泳问题处理

蛋白电泳中经常出现的问题和解决方法

1：“微笑”(两边翘起中间凹下)形带，主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所

    致，多出现于较厚的凝胶中。     处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

2： “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带

    主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，电泳槽，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

    处理办法：在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

3：出现拖尾现象?

 主要是样品融解效果不佳、样品降解或分离胶浓度过大引起的。

 处理办法：加样前离心;选择适当的样品缓冲液；电泳缓冲液时间过长，重新配制

4：电泳的条带很粗?

 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩的原因。

 处理办法：适当增加浓缩胶的长度;  保证浓缩  胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压

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核酸电泳凝胶的染色

凝胶的染色和观察凝胶中核酸带的染色，常用溴化乙锭法和银染法。前者与琼脂糖凝胶的染色方法相同。

银染法的灵敏度较高，可如下操作:

(1)将凝胶置固定液(10%乙醇，电泳槽，0.5%冰醋酸)中固定10分钟;

(2) 双蒸水洗1-2次;

(3) 置0.01mol/LAgNO3溶液中，室温反应15-30分钟;

(4) 充分水洗;

(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml3%NaOH，含1ml甲醛)中反应至条带显色清晰，本底适宜;

(6) 用5%冰醋酸终止反应。

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