如何分析Shotgun数据中的肽段覆盖率和蛋白得分？

在Shotgun蛋白组学中，我们往往会面对成百上千个被鉴定的蛋白和肽段。如何判断这些结果是否可信？哪些蛋白值得深入分析？哪些数据可以用于差异分析或功能注释？要回答这些问题，肽段覆盖率和蛋白得分是两个必须优先评估的关键参数。

一、肽段覆盖率分析：如何从覆盖程度判断Shotgun鉴定质量？

在Shotgun质谱数据初步处理完成后，软件通常会输出每个蛋白被检测到的肽段信息。此时，dìyī步建议查看肽段在蛋白序列中的分布和覆盖范围。

1、查看覆盖率百分比

在Shotgun数据分析平台（如MaxQuant、Proteome Discoverer等）输出的文件中，通常会显示每个蛋白的Sequence coverage %。研究者应优先关注覆盖率在30%以上的蛋白，尤其是那些在多个样本中重复出现的高覆盖率蛋白，这些更有可能是真实存在的、生物学意义明确的分子。

2、关注肽段分布是否集中在特定区域

如果肽段仅集中在蛋白N端或C端，或者只覆盖一个短片段，覆盖率不低，也要警惕可能是蛋白降解片段或数据库冗余引起的假阳性。可使用Peptigram等工具进行可视化比对，判断肽段是否分布在功能域区域。

3、结合蛋白结构信息进行判断

有些蛋白具有跨膜结构域、高疏水区或重复序列区域，容易造成酶切效率低、肽段不易被检出，从而导致覆盖率偏低。在Shotgun质谱策略中，这类结构化蛋白的识别难度更高，应结合蛋白功能与特征进行综合判断。

二、蛋白得分分析：如何筛选Shotgun鉴定中的可信结果？

蛋白得分是Shotgun蛋白质组学数据分析中至关重要的指标之一，它衡量的是肽段与数据库中蛋白匹配的统计显著性。其目的在于量化我们看到的匹配到底是真实存在还是随机噪音的产物。

1、确认得分是否超过可信阈值

多数Shotgun分析软件默认以1% FDR作为显著性标准，蛋白得分应至少满足该阈值。在MaxQuant中，Protein FDR、PEP等字段可辅助判断，得分过低、只被一个肽段支持的蛋白应谨慎使用。

2、结合肽段数量进行综合判断

得分高但仅由一个肽段支持的蛋白可能是虚高；得分中等但拥有多个高质量唯一肽段（unique peptides）的蛋白，在Shotgun实验中往往更具研究价值。建议在实际分析中优先筛选“得分高 + 肽段多 + 覆盖广”的蛋白。

3、排查冗余蛋白或共享肽段影响

在Shotgun蛋白质组策略中，由于多个蛋白可能共享肽段，造成部分蛋白得分虚高。此时应结合Leading protein字段，或通过特定算法合并冗余条目，以获得更真实、去重的结果列表。

三、联合分析覆盖率与得分，构建可信的Shotgun鉴定蛋白集

在实际项目中，仅依赖一个参数容易误判。Shotgun蛋白组数据分析应将肽段覆盖率与蛋白得分结合使用，构建更稳定可靠的核心蛋白集合。重点关注以下特征：

• 覆盖率 ≥30%，分布在不同结构域

• 得分显著，符合FDR过滤标准

• 拥有多个唯一匹配肽段

• 涵盖关键功能域或修饰位点

这样的蛋白更有可能代表样本中的真实生物学变化，适合用于后续的定量分析、通路富集和机制研究。

四、解析Shotgun数据常见陷阱

在分析Shotgun质谱结果时，常见问题包括：

• 只看得分不看覆盖分布：可能会误选降解产物或假阳性蛋白

• 忽视数据库质量：数据库冗余会放大共享肽段的问题，降低蛋白得分的区分度

• 未去除冗余信息：造成差异蛋白统计不准确

• 未可视化肽段位置：错过关键结构域覆盖，影响功能解释

建议建立标准化分析流程，结合项目背景，科学解读Shotgun数据中的关键指标，zuì大程度提高蛋白筛选的jīngzhǔn性。

肽段覆盖率与蛋白得分，是分析Shotgun蛋白组数据时的两个核心抓手。它们决定了蛋白鉴定的深度与可信度，也为下游差异分析与功能研究打下基础。通过科学评估这两个指标，研究者可以从海量数据中筛选出真正有意义的蛋白，为科研决策提供坚实的数据支撑。如您正在开展Shotgun蛋白组项目，欢迎联系百泰派克生物科技，我们将为您的数据质量、分析效率和科研成果保驾护航。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

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5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

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采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

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①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

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五、生物药物表征

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