如何通过质谱提高靶向PTM检测灵敏度？

蛋白质翻译后修饰（PTMs）如磷酸化、乙酰化、泛素化和糖基化在调控信号传导、细胞代谢和疾病发生中起关键作用。与普通蛋白相比，PTM蛋白往往低丰度、修饰位置多样且易降解，检测灵敏度和特异性是研究的核心难点。质谱（Mass Spectrometry, MS）因其高分辨率、定量能力和结构解析能力，已成为靶向PTM研究的核心工具。即便是高端Orbitrap或Q-TOF平台，如果前处理和方法不优化，也难以捕获低丰度修饰肽段。提升靶向PTM检测灵敏度需要从样品前处理、富集策略、质谱采集方法和数据分析四个层面入手。

一、样品前处理

1、高效蛋白提取与降解控制

（1）使用蛋白酶抑制剂防止体外降解，尤其是磷酸化蛋白易被磷酸酶去修饰。

（2）温和裂解条件：如尿素/SDC缓冲液，可以保持靶向PTM稳定提高蛋白溶解度。

（3）去除杂蛋白和盐类：杂质会抑制电喷雾电离（ESI），降低检测灵敏度。

2、酶切优化

（1）选择特异性蛋白酶：如trypsin常用，但对于某些修饰区域，可联合Lys-C或Glu-C提高肽段覆盖率。

（2）控制酶切时间和条件，避免过度酶切导致修饰丢失或肽段过短不易检测。

二、富集策略

低丰度PTM肽在复杂样品中容易被“淹没”，特异性富集是提高灵敏度的关键。

1、磷酸化肽

（1）IMAC（Immobilized Metal Affinity Chromatography）利用Fe³⁺或Ga³⁺捕获磷酸肽。

（2）TiO₂吸附法同样高效，可与IMAC串联，进一步提高磷酸肽回收率。

（3）多步洗脱策略优化回收降低非特异性结合。

2、乙酰化和泛素化肽

（1）抗修饰抗体富集：使用高亲和力抗乙酰赖氨酸或泛素残基抗体，可显著提高信号。

（2）化学标签捕获：如使用氨基反应性试剂标记特定修饰，结合亲和层析。

3、糖基化肽

（1）Lectin结合富集：根据糖基类型选择特异性Lectin。

（2）Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC)可进一步分离糖基化肽，减少杂质背景。

三、质谱采集策略

1、数据依赖采集（DDA）与数据独立采集（DIA）

（1）DDA适合发现新修饰，但灵敏度受低丰度肽随机采样限制。

（2）DIA通过系统采集所有肽段信号，提高低丰度PTM肽可检测性，增强重现性。

2、靶向MS（PRM/SRM）

（1）SRM（Selected Reaction Monitoring）或PRM（Parallel Reaction Monitoring）专注于预定义修饰肽段，显著提高灵敏度，可检测低至皮摩尔级别修饰。

（2）PRM结合高分辨率质谱，可减少背景干扰，提高靶向PTM定位精度。

3、多级质谱（MS³）

对于泛素化或磷酸化等复杂修饰，MS³扫描可进一步消除同质肽干扰，增强低丰度肽信号。

4、电喷雾优化

（1）使用微流量纳升液相（nanoLC-MS）提高电离效率。

（2）梯度延长降低复杂肽共洗脱干扰。

四、数据处理与定量优化

1、 jīngzhǔn峰识别

（1）使用高分辨率、高质量因子算法（如MaxQuant、Spectronaut）提高低丰度肽识别率。

（2）考虑靶向PTM特异性误差容忍设置，防止漏检。

2、定量方法

（1）标签定量：TMT、iTRAQ可提高相对定量灵敏度，适合复杂样品。

（2）标签自由定量：依赖高重复性和信噪比，适合靶向验证。

五、实验设计建议

（1）预实验筛选靶肽：优先选择离子化效率高、特异性好、位置固定的肽段。

（2）多维富集：结合IMAC/TiO₂或抗体+化学方法。

（3）优化LC-MS条件：微流量、长梯度、靶向PRM采集。

（4）重复采集与统计验证：保证低丰度信号可靠性。

（5）定制分析流程：结合PTM类型选择DIA/PRM和数据处理策略。

提升靶向PTM检测灵敏度不是单一因素，而是样品前处理 → 富集策略 → 质谱采集 → 数据处理的整体优化。通过科学设计实验流程，结合高分辨质谱和多维富集策略，是低丰度、复杂修饰蛋白，也能实现可靠检测与jīngzhǔn定量。百泰派克生物科技在PTM检测中整合高灵敏Orbitrap质谱、专属靶向PRM方法及优化抗体/化学富集方案，为科研机构和企业研发提供可重复、可量化的高灵敏PTM分析服务，助力前沿蛋白组学研究和jīngzhǔn生物标志物发现。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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