TMT定量蛋白质组学分析全流程指南：从样品到数据解读

生命科学研究中，定量蛋白质组学是探索疾病机制、寻找生物标志物和评估药物作用的核心工具。其中，串联质谱标签（Tandem Mass Tag, TMT）技术以高通量、多样本并行和高精度著称，被广泛应用于基础研究与转化医学。对于许多科研人员而言，TMT 实验的zuì大挑战不仅在于实验操作，还在于如何设计、控制质量，并zuì终获得可解释、可发表的数据。本文将提供一份完整的 TMT 定量蛋白质组学分析流程指南，帮助研究者系统掌握从样品到数据解读的关键步骤。

一、TMT定量蛋白质组学分析实验设计：为可靠数据打下基础

1、确定研究目标与分组

（1）明确研究问题，例如差异蛋白筛选、药物靶点验证或信号通路解析；

（2）合理设置实验分组和生物学重复（通常每组 ≥3 个样本）。

2、TMT 通道规划

（1）常见 10plex、16plex 和 18plex 设计，根据样本量和预算选择；

（2）为跨批次研究设置桥接样本（Bridge Sample），便于后续归一化。

3、随机化与平衡

随机分配样本到各 TMT 通道，避免系统性误差（如性别、年龄、处理时间的偏倚）。

二、TMT定量蛋白质组学分析样品制备：影响结果的关键环节

1、样品收集与保存

（1）组织样本需快速液氮冷冻，避免蛋白降解；

（2）血清或细胞需补加抑制剂（蛋白酶、磷酸酶抑制剂），维持蛋白状态。

2、蛋白提取与定量

（1）使用裂解缓冲液（含 SDS 或 Urea）提取总蛋白；

（2）BCA 法测定浓度，确保每个样本加载量一致。

3、酶解与肽段纯化

（1）通常采用胰蛋白酶消化，获得肽段混合物；

（2）通过固相萃取（SPE）去除杂质，保证后续标记效率。

三、TMT 标记与样本混合

1、标记反应

（1）每个样本用不同的 TMT 试剂标签标记；

（2）控制 pH 和反应时间，避免标签水解或交叉反应。

2、标记效率检测

（1）随机取部分样品进行质谱检测，确认标记率 ≥95%；

（2）若效率不足，需优化反应条件。

3、样本混合与分级

（1）将标记样本等量混合，确保每个样本信号权重一致；

（2）通过高 pH 反相分级减少样本复杂度，提高鉴定深度。

四、质谱分析：获取高质量数据

1、仪器选择

常用平台包括 Orbitrap Exploris、Q Exactive HF-X 和 timsTOF Pro，根据研究需求选择。

2、LC-MS/MS 参数优化

（1）选择适当的色谱梯度，提高肽段分离度；

（2）设置合适的碰撞能量，确保报告离子（Reporter ion）释放完整。

3、质控样本与标准品

加入 iRT 标准或 QC 样本监控保留时间和信号强度，及时发现系统波动。

五、数据处理与定量分析

1、数据库检索

（1）常用软件：Proteome Discoverer、MaxQuant；

（2）数据库需根据物种选择（如 UniProt-Human、Mouse）。

2、报告离子强度提取

（1）对 Reporter ion 强度进行归一化，减少批次效应；

（2）剔除低信噪比肽段，确保数据可信度。

3、差异蛋白筛选与统计学分析

（1）常用标准：Fold Change ≥1.5 且 p 值<0.05；

（2）结合 FDR 控制（通常 ≤1%），降低假阳性率。

六、TMT定量蛋白质组学分析结果解读与生物学分析

1、功能注释与富集分析

（1）利用 GO、KEGG 数据库解析差异蛋白的生物学功能；

（2）分析涉及的信号通路和代谢网络。

2、网络构建与可视化

（1）结合 Cytoscape 或 IPA 构建蛋白互作网络；

（2）通过热图、火山图、富集气泡图等方式展示核心结果。

3、与其他组学数据整合

将 TMT 数据与转录组、代谢组结合，从系统层面揭示生物过程调控。

七、常见问题与优化建议

1、标记效率低

（1）检查缓冲体系 pH 是否合适；

（2）确保标签试剂无水分污染。

2、批次效应显著

（1）使用桥接样本（Bridge Sample）进行跨批次标准化；

（2）在数据处理时加入批次因子校正。

3、低丰度蛋白覆盖不足

（1）增加样品上样量或采用离线分级；

（2）使用zuì新一代 Orbitrap 平台提高灵敏度。

TMT 定量蛋白质组学凭借高通量、低偏差和jīngquè定量能力，已成为疾病机制研究、标志物发现和药物研发的重要技术。掌握完整的实验设计与数据分析流程，是获得可靠、可发表结果的前提。如果您计划开展 TMT 蛋白质组学项目，欢迎联系百泰派克生物科技，获取zhuānyè的实验设计建议与一站式技术服务支持。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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