定量磷酸化蛋白组学中的内参选择与归一化策略

在进行定量磷酸化蛋白组学分析时，我们往往关注磷酸位点的差异表达、上下调趋势与功能通路富集。但忽略内参选择与数据归一化策略，极易造成伪差异、定量偏差甚至生物学误导。由于磷酸化肽段具有低丰度、高变异性等特点，以往蛋白组学的归一化思路无法直接套用。在定量磷酸化蛋白组学中，合理的内参标准和归一化方法，是确保数据可信性、增强组间可比性、挖掘真实生物学变化的前提。

一、内参选择的原则与挑战

1、为何定量磷酸化蛋白组学难以直接使用“总蛋白”归一化？

在蛋白组学中，“总蛋白量”或“所有肽段平均强度”可作为归一化参考。但在磷酸化组学中，这一策略面临两个技术障碍：

（1）富集步骤打破了肽段组成的均一性

磷酸肽富集（如IMAC、TiO₂）后，非磷酸肽大量丢失，导致总信号强度不能准确代表蛋白丰度。

（2）磷酸化水平变化可能独立于蛋白表达

某些信号通路激活下，磷酸化显著上调，但蛋白本身无表达变化，此时使用蛋白量归一化将掩盖真实信号。

2、yōuxiù内参应具备的三个标准

满足这三点的肽段/蛋白，才能在定量中作为可靠的“基线”。

二、常见定量磷酸化蛋白组学归一化策略对比

1、基于总磷酸化肽段信号的归一化（Global Scaling）

（1）原理： 假设总体磷酸化水平在不同样本中相近，将每个样本所有磷酸肽信号强度做总和，进行缩放调整。

（2）优点：

① 实现简单，适用于多数TMT或LFQ数据；

② 不依赖额外定量步骤。

（3）局限：

① 在“全局磷酸化水平大幅变化”的条件下（如药物处理），会误判真实信号；

② 不适用于激酶强激活、磷酸化泛增模型。

2、使用非磷酸化肽段作为内参

（1）原理： 检测磷酸肽和对应非磷酸肽，使用后者作为内参衡量蛋白表达水平。

（2）优点：

① 可区分“磷酸化调控” vs “蛋白表达变化”；

② 适合位点特异性研究。

（3）局限：

① 需高质量未富集样本配合；

② 数据量大、分析复杂，不适合大规模筛查项目。

3、基于特定“稳定蛋白”的归一化

（1）原理： 选择在各样本中稳定表达的housekeeping蛋白（如GAPDH、ACTB、HSP90）或磷酸化不敏感蛋白，作为内参。

（2）优点：

① 简单直观，适合少量样本校准；

② 易于生物学解释。

（3）局限：

① Housekeeping蛋白本身也可能被磷酸化调控；

② 适用范围有限，需先验证其稳定性。

4、基于MSstats、NormalyzerDE等工具的统计归一化

（1）原理： 应用统计算法（如Loess、quantile normalization等）自动调整系统偏差。

（2）优点：

① 自动化强、通量高；

② 可适用于大规模比较组、多重复数据。

（3）局限：

① 黑箱操作可能掩盖生物学变化；

② 依赖数据结构合理、无异常样本。

三、归一化之后，还需要哪些“质量评估”？

（1）CV值（变异系数）评估：重复样本之间CV值是否低于20%；

（2）PCA主成分分析：组间是否明显分离，组内是否聚类；

（3）火山图/热图可视化：变化是否符合生物预期；

（4）激酶通路富集趋势：是否存在伪上调或集体偏差现象。

在定量磷酸化蛋白组学中，归一化不只是“格式化数据”的技术操作，更是影响数据解读与研究的重要变量。一个不合理的内参选择或归一化方法，可能掩盖真正的调控网络，甚至导致“假阳性”。我们建议将内参选择与归一化策略前置纳入实验设计阶段，并与数据分析人员充分沟通，制定科学、合理的定量方案。如您在磷酸化定量项目中有归一化相关困惑，欢迎随时咨询百泰派克生物科技。我们不仅提供高质量的实验平台，更致力于帮助客户构建可靠的生物学

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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