基于质谱的蛋白质磷酸化检测技术全解析

蛋白质磷酸化（phosphorylation）是zuì常见也是zuì关键的翻译后修饰之一，广泛参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等生命过程。通过对磷酸化位点的jīngzhǔn鉴定与定量分析，科研人员得以系统性解码细胞信号网络的动态变化，揭示疾病发生机制，甚至发现潜在的药物靶点。在众多分析手段中，基于质谱的蛋白质磷酸化检测技术因其高通量、分子层面解析能力强，已成为现代蛋白组学研究的核心工具。

一、质谱如何检测蛋白质磷酸化？

1、离子特征决定磷酸化可检测性

磷酸基团的引入改变了肽段的理化性质：分子质量增加79.966 Da，且在正离子模式下易发生中性丢失（loss of H₃PO₄, 98 Da）。这一特性为质谱识别磷酸化提供了切入点。

2、主要质谱平台与碎裂方式

现代质谱平台，如Orbitrap Fusion Lumos或timsTOF Pro 2，配合多种碎裂方式（CID、HCD、ETD），可实现对磷酸肽的高灵敏度识别。常用策略包括：

（1）CID（碰撞诱导解离）：易产生磷酸基团中性丢失，利于磷酸化位点初筛；

（2）ETD（电子转移解离）：保留修饰信息，适合定位多磷酸化位点；

（3）HCD（高能碰撞解离）：提供高质量b/y离子谱图，兼顾定性与定量。

二、实验流程：从样本到数据的关键步骤

1、样本预处理与蛋白提取

磷酸化修饰通常为低丰度事件，样本处理需格外谨慎。使用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂能有效防止修饰丢失。随后进行裂解、定量、还原烷基化和酶解。

2、磷酸肽富集：决定分析成败的关键步骤

由于磷酸化肽在复杂背景中含量极低，富集是必不可少的一环。主流方法包括：

（1）IMAC（Immobilized Metal Affinity Chromatography）

利用Fe³⁺、Ga³⁺等金属离子与磷酸基团的亲和力。

（2）TiO₂富集（Titanium Dioxide）

适用于单磷酸化肽，选择性高。

（3）抗体富集（phospho-tyrosine antibody）

特异识别酪氨酸磷酸化，常用于信号通路研究。

3、LC-MS/MS分析与数据采集

富集后的磷酸肽样本通过纳升级高效液相色谱进入高分辨质谱仪进行扫描。DDA（Data-Dependent Acquisition）和DIA（Data-Independent Acquisition）两种数据采集策略各有优势，前者适用于新靶标发现，后者适合已知磷酸位点的高通量定量。

4、数据分析与磷酸化位点鉴定

基于搜索引擎（如MaxQuant、Proteome Discoverer、Spectronaut）的数据库比对，结合定位打分（Ascore、ptmRS）即可准确标注磷酸化位点。进一步分析如富集分析、激酶预测（Kinase-substrate prediction）有助于构建信号通路网络图谱。

三、技术挑战与解决策略

四、应用场景：从基础研究到临床转化

1、肿瘤信号通路研究

例如PI3K/AKT、MAPK等路径活化分析

2、药物靶点验证与激酶抑制剂筛选

利用磷酸化定量判断药物干预效果

3、免疫应答与炎症通路解码

多激酶协同作用的动态变化追踪

4、个性化医学中的生物标志物筛选

利用临床样本进行磷酸化组图谱构建

基于质谱的蛋白质磷酸化检测技术已经成为现代蛋白质组学研究的基石之一。通过优化样本处理流程、富集策略和质谱采集方式，科研人员可以在复杂背景中jīngzhǔn捕捉低丰度、动态变化的磷酸化修饰，为疾病机制探索和药物开发提供强有力的数据支持。如果您正在进行细胞信号通路、激酶研究或新药靶点挖掘，欢迎联系百泰派克生物科技，我们将助您走得更远。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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