基于LC-MS/MS的免疫肽组学分析工作流程详解

随着免疫治疗成为肿瘤、病毒感染和自身免疫疾病干预的研究热点，人类对抗原呈递机制的认知也不断深入。在此背景下，免疫肽组学（Immunopeptidomics）应运而生，成为连接分子组学与免疫学之间的关键桥梁。该技术致力于全面识别由主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递至细胞表面的肽段集合，这些肽段可以直接被T细胞识别并触发免疫反应。免疫肽组学不仅在新型疫苗的开发中具有广阔前景，也为个体化癌症免疫疗法提供了可靠的抗原筛选依据。基于LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）的免疫肽组学分析技术，能够在实际生物样本中直接检测MHC分子所呈递的肽段，被视为当前研究抗原呈递机制zuì直接、zuì可信的技术路径。本文将系统梳理基于LC-MS/MS的免疫肽组学分析流程，从样本制备到质谱检测，再到数据解析，帮助科研人员深入理解这一前沿技术的实施要点与应用价值。

一、免疫肽组学的基本原理与研究对象

免疫肽组学的研究对象为由MHC-I或MHC-II分子呈递的内源性肽段。这些肽段来源于细胞内蛋白质的降解产物，反映了细胞的分子状态，包括癌变、感染或应激等。MHC-I主要呈递来自胞内的8–11个氨基酸的短肽，用于激活CD8+ T细胞，而MHC-II则负责呈递更长的肽段（13–25个氨基酸），激活CD4+ T细胞。

研究重点通常包括：

• 肿瘤相关抗原（TAA）

• 肿瘤特异性新抗原（Neoantigen）

• 病原体源性抗原（如病毒、细菌）

• 自身抗原（与自身免疫疾病相关）

这些肽段是开发个体化疫苗、TCR-T疗法以及靶向治疗策略的核心依据。

二、基于LC-MS/MS的免疫肽组学完整实验流程

免疫肽组学实验面临的zuì大挑战是目标肽段的低丰度、高复杂性。需要在实验设计上高度优化，以提高检测灵敏度和数据质量。

1、样本准备

常用的样本包括癌细胞系、患者肿瘤组织、PBMC、HLA转染细胞等。由于MHC呈递的肽段数量稀少，通常需要上亿级细胞量或等效组织量，以获得可检测水平的免疫肽。

2、MHC分子的免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）

使用特异性抗体（如W6/32用于HLA-I）偶联磁珠或琼脂糖凝胶，进行免疫共沉淀以富集MHC-肽复合物。该步骤的关键在于样本裂解的完整性与抗体的结合效率，直接影响下游肽段的纯度与回收率。

3、弱酸洗脱肽段

使用0.1% TFA等弱酸条件洗脱MHC结合的肽段。洗脱液中含有大量背景物质，需要快速、低温操作，防止蛋白降解，并zuì大限度保留目标肽段。

4、肽段净化与浓缩

洗脱液经C18固相萃取柱纯化，以去除盐分、表面活性剂等干扰物。必要时可进一步进行高pH反相分级，提高低丰度肽段的检测概率。

5、LC-MS/MS分析

采用高分辨率质谱平台（如Orbitrap Exploris、Fusion Lumos等），在无酶切设置下进行全扫描分析。数据采集模式通常为DDA（Data-Dependent Acquisition），也可采用DIA（Data-Independent Acquisition）提高覆盖率。

推荐参数设置包括：

（1）动态排除以避免冗余扫描；

（2）更长的色谱梯度以提升分离度；

（3）更高的AGC与分辨率以增强灵敏度。

6、数据分析与抗原筛选

数据分析需使用支持无酶切搜索的算法（如MaxQuant、PEAKS、Byonic），并设置合适的假发现率（FDR ≤ 1%）。随后将肽段与目标细胞或组织的HLA型信息比对，确认其MHC限制性。结合体细胞突变数据与转录组数据，可筛选出具有免疫原性的新抗原候选。

三、免疫肽组学的应用前景

免疫肽组学作为一种连接细胞蛋白质降解产物与T细胞识别机制的技术，正在多个研究和应用领域展现巨大潜力：

1、个体化肿瘤疫苗设计：通过识别病人特异的新抗原，提高T细胞激活效率；

2、TCR-T或CAR-T靶点发现：确认表达特异性强、免疫原性高的抗原呈递肽；

3、病毒或病原体疫苗开发：例如新冠病毒变异株特异抗原筛选；

4、自身免疫疾病机制研究：识别潜在诱导自身反应的自身抗原肽段。

随着质谱技术、算法能力和多组学整合手段的不断提升，免疫肽组学将在jīngzhǔn免疫治疗领域扮演越来越关键的角色。

免疫肽组学以其高度的生理相关性与技术前瞻性，正在重塑我们对抗原识别与免疫响应的理解。基于LC-MS/MS的肽段直接鉴定方式，已成为新抗原发现和个体化免疫疗法开发的重要支撑平台。未来，随着样本处理效率与算法精度的不断优化，免疫肽组学有望为jīngzhǔn医学带来更多突破。如需定制免疫肽组学研究策略，欢迎联系百泰派克生物科技获取技术咨询与方案支持。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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