单克隆抗体生产中的HCP抗体覆盖率分析

在单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）等重组蛋白药物的大规模生产过程中，宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）作为工艺过程中产生的内源性杂质，是监管部门高度关注的质量控制指标之一。这些蛋白来源于表达系统（如CHO细胞），可能在细胞裂解、培养或纯化过程中被携带至zuì终制剂中，即便其残留水平极低，仍可能引发免疫原性、蛋白降解、药效干扰或稳定性下降等一系列潜在风险。为了监测并控制HCP残留，目前业内广泛采用酶联免疫吸附法（ELISA）作为shǒuxuǎn检测手段。ELISA的有效性本质上取决于所用抗体是否能够“看见”足够多的HCP种类。在ELISA方法学验证中，HCP抗体覆盖率分析（Antibody Coverage Analysis）被视为衡量其适用性和可靠性的重要依据。

一、单克隆抗体项目需要进行抗体覆盖率验证的原因

1、CHO表达系统存在HCP背景差异

（1）同为CHO细胞，不同公司、不同培养基、不同工艺条件下，表达出的HCP种类显著差异

（2）商业抗体未必能全面识别目标项目的特定HCP谱

2、申报资料合规性要求明确

（1）FDA、EMA、NMPA对HCP检测方法学验证有严格要求，必须提交抗体覆盖率数据

（2）特别是在使用商业抗体或平台方法时，更需验证其适配性

3、避免潜在的质量盲区与安全风险

（1）若未被抗体识别的HCP在终产品中持续残留，可能导致免疫原性或稳定性问题

（2）一旦申报过程中被发现“覆盖不足”，可能导致方法质疑、补充试验或申报延后

二、单克隆抗体HCP抗体覆盖率验证的推荐方法

1、二维Western印迹法（2D-Western Blot）

（1）核心原理：通过二维电泳将总HCP分离后，用待验证抗体显色识别其可结合的蛋白点位

（2）分析方式：将抗体识别图谱与染色图谱比对，统计蛋白点位

（3）结果输出：覆盖率（%）= 抗体识别点数 ÷ 总HCP蛋白点数 ×

2、免疫亲和富集-质谱法（IA-MS）

（1）将抗-HCP抗体偶联至磁珠，富集其识别的蛋白群

（2）经酶解+LC-MS/MS鉴定后确认蛋白身份，实现蛋白种类层面的覆盖验证

（3）适合补充确认2D-WB的图谱结果，或对关键HCP种类进行深入识别

3、辅助方法：2D-DIGE & ELISA响应比对

（1）荧光双染可辅助可视化识别差异

（2）ELISA响应对比适合初筛，但无法进行定量覆盖率分析

三、2D-Western在mAb覆盖率验证中的实施要点

1、样品准备

（1）建议使用中试/临床样品中的CHO细胞裂解液或发酵中间液

（2）确保HCP样本具有代表性（体现实际工艺）

（3）蛋白浓度推荐控制在1–2 mg/mL，利于点位清晰分离

2、实验流程概览

（1）dìyī维：等电聚焦（IEF）分离蛋白等电点（pI）

（2）第二维：SDS-PAGE分离分子量

（3）膜转印：一张Coomassie染色记录总HCP，一张Western显影记录抗体识别部分

（4）图像比对与点位统计：使用软件如ImageMaster或PDQuest分析并计算覆盖率

3、质量标准参考

（1）国际通用覆盖率参考值 ≥70%

（2）若小于60%，建议优化免疫原或更换抗体来源

四、影响mAb覆盖率验证准确性的关键变量

1、抗体批次与免疫原差异

① 同一抗体不同批次间覆盖能力可能存在差异，需单独验证

② 使用更贴近目标工艺的免疫原（如实际HCP提取物）可有效提升覆盖率

2、电泳分辨率与染色方法

① 使用pH 4–7 IPG胶条提升分辨率

② 银染或高灵敏Coomassie染色更利于弱表达蛋白识别

3、图谱比对的主观误差

① 软件+人工双重审阅机制可有效降低识别偏差

② 点位数不应低于150–200个，以提升统计学代表性

在单克隆抗体产品的CMC研究中，HCP抗体覆盖率验证并非“可选项”，而是决定ELISA方法科学性、产品质量一致性和注册合规性的“硬指标”。通过标准化的2D-Western验证策略与蛋白种类识别技术，企业才能真正建立起科学、可申报、可追溯的HCP控制体系。百泰派克生物科技已为数十个mAb项目成功完成抗体覆盖率验证与ELISA平台搭建，助力客户从早研走向临床、从IND迈向BLA，以更稳健的质量体系迎接全球市场挑战。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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