如何通过蛋白全长测序验证复杂异构体的存在？5步操作指南

在蛋白表达系统中，来源于同一基因，所产生的蛋白质也可能因剪接变异、翻译起始差异、翻译后修饰或降解途径不同，形成多个结构相似但功能各异的蛋白质异构体（protein isoforms）。这些异构体广泛存在于天然蛋白中，尤其在抗体药物、融合蛋白及重组酶等生物制品开发过程中，其微小的结构差异可能对蛋白功能、稳定性和免疫原性产生重要影响。

当前，质谱已成为解析蛋白结构和鉴定异构体的工具。在此基础上，蛋白质全长测序（de novo full-length protein sequencing）通过高覆盖度裂解、深度谱图采集及智能化拼接算法，实现了从一级结构层面对异构体的jīngquè定性与区分。该方法无需参考数据库，可捕捉剪切、延伸、修饰等结构变化，是研究复杂异构体组成的有力手段。

dìyī步：评估异构体验证的必要性

在启动全长测序前，需判断是否具有开展异构体验证的价值与必要性。

• 是否存在剪接体或翻译变体的可能性？（如选择性剪接、起始位点差异）

• 是否在SDS-PAGE、SEC或常规质谱中观察到多条带或多个峰？

• 是否有数据库注释或文献报道多个结构变体？

• 是否怀疑存在功能差异或免疫原性差异？

若具备上述因素，建议从一级序列出发进行直接验证。百泰派克生物科技提供数据库分析、结构预测和差异片段富集建议，辅助判断项目适配性。

第二步：构建多酶裂解与高覆盖度测序策略

异构体的关键差异多发生在：

• N端或C端的延伸或截断

• 可变区（如抗体J区、交联位点）

• 翻译后修饰所致的微结构差异

为全面覆盖上述区域，可采用多酶联用方案（如Trypsin、Glu-C、Asp-N、Chymotrypsin等），设计overlapping digestion策略，并结合预富集流程，提高检测灵敏度与解析分辨率。

第三步：高分辨质谱+多碎裂模式识别异构特征

异构体往往差异微小，需采用高性能质谱平台进行jīngquè分析。推荐配置包括：

• Orbitrap Eclipse或timsTOF Pro 2等高分辨仪器

• 组合碎裂模式（HCD+ETD/EThcD），便于修饰识别与N/C端结构完整性分析

• label-free定量模式，辅助判断各异构体相对丰度

尤其在修饰与剪接结构共存的复杂样本中，多模式碎裂可显著提升结构解析能力。

第四步：AI辅助de novo拼接与异构体重构

利用AI驱动的de novo测序工具，可从MS/MS谱图中直接重构一级序列，规避数据库匹配的局限。主流算法包括：

• PEAKS Studio X+

• pNovo、DeepNovo

建议对候选差异区域进行多版本拼接，识别残基替换、缺失、延伸或修饰，输出多个高置信度异构体模型，并建立与原型蛋白的结构比较。

第五步：多维验证与功能关联分析

确认异构体存在后，需从功能层面验证其生物学意义。推荐方法包括：

• 合成特异肽段进行功能验证或结合抗体检测

• RT-PCR或转录组测序验证是否来源于剪接异构体

• Western blot结合专一性抗体区分异构体表达

• 稳定性、活性和免疫原性差异检测，评估药物开发影响

蛋白质异构体在药物开发与功能研究中扮演着复杂而关键的角色。蛋白全长测序通过无偏序列解析能力，配合多酶裂解、高分辨检测与AI拼接建模，为异构体的识别提供结构级解决方案。百泰派克生物科技在全长蛋白质测序与异构体分析方面具备成熟平台与丰富经验，已协助多家科研机构识别功能相关异构体结构，助力蛋白药研发与机制研究向更深层次推进。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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