Invitrogen Qubit 4荧光计
尤其适合样品珍贵、对准确性要求极高的应用领域
哪些用户需要使用Qubit 4 荧光计？
如果您的样品十分珍贵或用于精密应用领域，或者您为了获得研究结果进行了巨大的投入，那么Invitrogen™Qubit™ 4 荧光定量计就是您的理想之选。想想下面这些问题：
— 需要快速检测RNA样本的完整性和质量？ — 我的样品十分珍贵难以处理吗？
— 提取后的DNA、RNA或蛋白质量很少吗？ — 该样品将被用于成本高昂的下游实验吗？
— 我要使用诸如实时定量PCR(qPCR) 或下一代测序方法等需要精密测定的实验方法吗？
—我要进行诸如转染等需要几天甚至几周才能获得结果的实验吗？
—我的样品制备过程复杂需要诸如激光捕获显微切割等特殊技术吗？
为什么要使用Qubit4 荧光计？
Qubit 4荧光计采用专门研制的荧光检测技术和Invitrogen™ Molecular Probes™染料。这些染料荧光只有与特异性的靶分子结合时，才能发射荧光信号，有游离核苷酸或降解核酸存在，这些染料仍能发挥作用。Qubit 4荧光定量即便在低浓度下亦具有目前zui高的DNA 和RNA定量特异性和灵敏度。
※ 选择性 — Qubit荧光定量( 图1) 采用Qubit 分析试剂盒( 表1)，其包括专利的染料，只有与DNA、RNA或蛋白质结合时方可发出荧光。由于Qubit 技术只报告靶分子( 而不是杂质)的浓度，这种特异性可以使您获得十分的结果
图1. Qubit荧光定量系统。
表1. Qubit分析试剂盒的分析范围。
※ 灵敏性 —zui低仅需1 uL样品，能可靠地定量浓度仅为10pg/_L 的DNA 和12.5μg/mL 的蛋白质样本
※ 简单直观 —反应灵敏的5.7 英寸彩色触摸屏，直观的导航按钮
※ 迅速 —全新的双核处理器，5 秒内快速计算样品浓度，zui多存储1000个结果
※ 个性化 —个性化设置常规应用，可通过MyQubit 软件和网络工具创建个性化assay，六国操作语言可供选择
上市12 年来，Qubit荧光计一直以其极高的准确度和灵敏性，受到全球上万个实验室的青睐。迄今为止，已经有17,500 篇有关Qubit的文献引述。zui新推出的Qubit 4荧光计秉承上一代仪器的高准确性，不仅仅可测量样品DNA，RNA 和蛋白质含量，还拥有全新的功能，包括：
※ 适用全新RNA IQassay — 快速可靠地检测RNA 完整性和质量
※ 数据导出 — 除U盘和USB 连接电脑导出数据，还拥有WiFi 功能
※ 内置试剂计算器 —快速计算配置工作溶液所需的染料和缓冲液
Qubit荧光定量的工作流程
Qubit荧光定量采用荧光染料对目标生物分子进行定量
采用Qubit 4荧光计完成的Qubit 分析均采用同一种通用实验方案。进行DNA 和RNA 分析只需混合读数，孵育时间仅为2分钟，蛋白质分析孵育时间为15 分钟( 图2)。请登录 thermofisher.com/qubit，查看Qubit分析的实验方案。实验完成，Qubit 4 荧光计会自动保存您的实验数据，zui多1000个。您也可以通过U 盘，USB 数据线或WiFi 导出数据。
将染料和缓冲液置于室温下储存，以获得zui佳结果。DNA、RNA和蛋白质标准品置于4℃储存。使用前，确保所有分析试剂均在室温下。
* 除了常用的 dsDNA,oligos, total RNA, microRNA, RNA IQ 和 protein 分析之外，使用Ion SphereQuality Control Kit，还可用于检测Ion Sphere Particle 的质量，以用于Ion PGM测序仪。
图2. 采用Qubit 4 荧光计进行Qubit分析的工作流程。
Qubit操作简单直观
内置试剂计算器。输入样品和标准品的数量，使用此工具可帮助您快速计算配置工作溶液需要的染料和缓冲液。
Qubit荧光定量与NanoDrop及其它紫外分光光度计定量方法有何不同？
ThermoScientificTM NanoDropTM及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测，它无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。而Qubit定量平台采用荧光染料检测特异目标分子的浓度。
紫外吸收定量法是常用的一种DNA 或RNA定量方，但其读数并不可靠且不(1-4)。紫外吸光度读数不加区别检测吸光度为260nm的所有物质，包括DNA、RNA、蛋白质、降解核酸和游离核苷酸。由于Qubit 4 荧光计只检测目标分子，其读数一般低于A260读数，定量更。
分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的定量。Qubit 4 荧光计能在较低的浓度范围内得出比采用NanoDrop分光光度计进行紫外吸收检测更准确、精密的结果(图3)。鉴于上述缺点，使用荧光染料定量核酸已成为一种常见的替代方法[5–8]。
低浓度下的准确度和精度比较
Qubit荧光定量能在较低的浓度范围内得出比采用NanoDrop分光光度计进行紫外吸光度检测更准确、更精密的结果。采用Qubit dsDNAHS 分析试剂盒及Qubit 荧光计，定量浓度仅为10pg/_L 的样本中的DNA，测得值在实际值的±12% 范围内(图3A)。而采用NanoDrop 分光光度计测量上述相同样本，测得的浓度比实际值高46 倍。使用Qubit 荧光计检测低至10ng/_LDNA 的样本(NanoDrop 分光光度计的报道下限值为2 ng/_L)，测得值在实际值的±1%范围内，使用NanoDrop 分光光度计测定的浓度在实际值的±5% 范围内。采用Qubit 荧光计检测DNA 浓度低至0.5ng/_L 的样本，所有样本的重复差异(%CV)均_1% ( 图3B)。而采用NanoDrop分光光度计检测，只有DNA浓度为4ng/_L 及以上的样本的%CV 低于9%。
图3. Qubit荧光定量的准确度和精度。根据标准试剂盒实验方案，在Qubit 荧光计中采用Qubit dsDNA HS 分析试剂盒重复10次测量浓度在0.01至10ng/_L 之间的lambda DNA。采用NanoDrop ND-1000 分光光度计重复10次测量相同浓度的DNA，比较结果的准确度(A) 和精度(B)。准确度定义为与已知浓度的平均偏差。标示的浓度是在Qubit分析管中稀释前起始样本的DNA 浓度。
针对DNA或RNA 的选择性比较
采用Qubit荧光定量和紫外吸光度测量核酸浓度zui明显的差异在于Qubit分析的选择性，Qubit 分析针对目的分子具有极高的特异性，可提供较紫外吸光度更准确的信息。采用紫外分析时，含有DNA 和RNA的样本结果无差别，您无法将它们DNA和RNA 区分开来。而Qubit 荧光定量能够准确测定同一样本中的DNA 和RNA (图4)。在本实验中，样本含有相同含量的DNA和RNA，采用Qubit dsDNA BR 分析试剂盒测得的DNA 浓度在实际含量的±2%范围内。在RNA 含量较DNA 高10倍的样本中，采用DNA 分析测得的浓度仅比实际值高7%。而采用NanoDrop分光光度计进行紫外吸光度检测，无法准确测量上述样本中的DNA 和RNA 含量，这增加了后续实验中出错的可能性。
图4. Qubit分析与紫外分光光度法相比具有选择性。采用Qubit dsDNABR 和Qubit RNA BR 分析试剂盒及Qubit荧光计，按照试剂盒实验方案检测含有lambda DNA (10 ng/uL) 和不同量的大肠杆菌核糖体RNA (0-100ng/uL) 的样本，每个样品重复3 次。采用NanoDropND-1000分光光度计检测同一样本三次，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度计检测一次。标示的浓度是在Qubit分析管中稀释前起始样本的DNA和RNA 浓度。红色和橙色趋势线分别表示起始样本中DNA 和RNA 的实际含量。( 分别)稀释纯的浓缩DNA 和RNA 溶液，采用PerkinElmer Lambda 35 分光光度计测定260 nm处的光密度，使稀释后溶液的光密度值为1.0，设定核酸的实际浓度。计算储液浓度，用于后续稀释。采用紫外分析时，含有DNA和RNA 的样本结果无差别- 您无法将它们区分开来。
灵敏度和范围比较
采用Qubit荧光计及Qubit 分析试剂盒的灵敏度高于紫外吸光度检测，由于该分析能够检测1–20uL的样本，分析的有效范围扩大。Qubit dsDNA HS 和BR 分析试剂盒覆盖的样本浓度范围为10 pg/uL 至1ug/uL DNA。据制造商报道，NanoDrop 分光光度计覆盖的样本浓度范围为2 ng/uL 至15ug/uL，Qubit 适合的浓度范围更宽，高浓度样本在分光光度计上测定就不必稀释。
如何创建个性化的分析应用？
荧光计模式
选择荧光计模式，Qubit 4荧光计就可以被用做小型的荧光计。在荧光计模式里，不同于使用分析试剂盒时的校准和基于算法的计算结果，仪器直接产生并显示每个样本的原始荧光数据(RFU)。荧光计模式允许您可以手动选择发射光源：蓝色LED( zui大~470nm)或红色LED ( zui大~635nm)。如果选择蓝光发射，仪器读取绿色或远红外通道的荧光；如果选择红光发射，则仅读取远红外通道的荧光。
通过荧光计模式收集的数据可以用于设计您的个性化assay配合MyQubit 创建新的分析类型。
MyQubit-为Qubit 4 荧光计设计和创建新的分析类型
Qubit 4 荧光计与MyQubit assay设计工具兼容。您只需在此在线工具上输入您的assay 参数，保存并上传.qbt 文件至您的Qubit 4荧光计，即可运行您的个性化分析，拓展Qubit 的应用范围。
* 目前，我们已开发6 个新的分析(胆固醇、葡萄糖、半乳糖、谷氨酸、过氧化氢、蔗糖分析)，如有需要可直接下载上传至您的Qubit。
Qubit RNA IQAssay
快速、准确地检测RNA完整性和质量
RNA样品的质量评估对于下游的实验的成功尤为重要。全新上市的InvitrogenTM Qubit RNA IQ（Integrity &Quality ）试剂盒和Qubit 4 荧光计配套使用，只需两步就可以准确区分完整和降解RNA，快速评估RNA质量或降解程度。无需特殊的处理步骤，繁杂的样本制备或漫长的等待过程——zui少仅需1uL，浓度为0.5-1.5 ug/uL 的待测样品，即可在4 秒内获得RNA IQ 结果。
Qubit RNA IQ试剂盒采用两种独特的荧光染料——一种与大RNA，完整和/ 或结构RNA结合，另一种选择性地结合较小、降解的RNA（图5），两种染料结合使用，可快速地评估RNA样品的完整性和质量。使用时，您只需将样本加入RNAIQ 工作液，在Qubit 4 荧光计上完成检测。检测结果会提供RNA 样品完整性和质量的总数值或RNAIQ#，以及样本中大小RNA 的百分比值（图6）。与其他RNA 质量分数类似，RNAIQ# 评分范围为1 到10，数值越大，说明RNA的质量越高，完整性越好。
图5. RNA IQ试剂选择性结合大RNA 和小RNA。三个含相同100 ng/mL rRNA (E. coli) 和不同含量siRNA (0 to50ng/uL) 的样本都使用 Qubit RNA IQ assay (Q33221, Q33222) 在 Qubit 4荧光计上检测。A 图和B 图分别展示了相对荧光单位值RFUs) (A) 和IQ# 值 (B) 。
图 6. Qubit 4荧光计和QubitRNA IQ 结果
与电泳法相比，RNAIQ 检测法有何优势？
Qubit RNA IQ为检测RNA 样本是否降解提供一种快速简单的方法。与基于微流体芯片法比较，RNA IQ法需要的设备便宜，操作简单，更重要的是检测所需的时间大大缩短。通常来说，完成12 个样品的检测，RNA IQ 法约需要10分钟，而使用微流体法，约需要75 分钟。如果您只是需要简单评估RNA 样品是否降解，可以使用RNA IQ法快速完成检测，但如果您需要获取具体的RNA 片段大小及分布信息，我们依然推荐您使用基于凝胶或微流体的电泳方法。
RNA IQ检测结果反映样本中大RNA 和/ 或结构RNA 和小RNA的百分比，其数值与电泳法结果正相关（图7）。需要注意的是IQ#值反映的是样本中大小RNA 的比值，由于计算原理不同，IQ#值与其他质量评估方法得到的结果之间存在一些差异（图8）。对特定样本或下游应用，我们推荐您zui开始使用RNA IQ试剂盒和传统电泳法来确定测量值的相关性。
图 7. rRNA 经RNase酶处理，随后用Qubit RNA IQ Assay或 Agilent Bioanalyzer™ 仪器评估完整性和质量。将750fMRnase A 加入相同量的 100 ng/mL rRNA (E. coli) 溶液中，在不同的时间点用RNase OUT处理，用Qubit RNA IQ Assay 在Qubit 4 荧光计 (A) 仪器或 AgilentBioanalyzer™Prokaryote TotalRNA Nano chip (B) 检测。
图 8. 总RNA经RNAase 处理1 min 后， 使用 QubitRNA IQ assay 和 Agilent Bioanalyzer™仪器检测RNA 完整性和质量。 rRNA 经0.5pg/μL RNase A 处理，1 min 后加入 RNaseOUT 。样品通过ProkaryoteTotal RNA Nano Chip 或Qubit RNA IQ Assay （货号：Q33221,Q33222) 在 Qubit 4 荧光计上检测。质量分数的差异，IQ#: 9.8 和 RIN#: 8.9 是 5s rRNA 和tRNA 展示三级结构和结合大RNA 染料的信号结果。
仪器参数：
订购信息：
注：
1. Qubit RNA IQassay 和Qubit 4 System Validation Assay 只可以在Qubit 4 上使用，不可用于Qubit、Qubit 2.0 或Qubit 3 荧光计。
2. Qubit RNA XRkits 相比 Qubit RNA BR kits，拥有更宽的动态范围。
3. Qubit 1XdsDNA HS Assay Kit 为即用型试剂盒，无需配置工作液，直接加样即可上机检测，与Qubit dsDNA HS Assay拥有相同的灵敏度。
4. 新品1X dsDNA HS或 RNA XR assays 亦适用于Qubit 2.0 和Qubit 3 荧光计，但需要从网站下载MyQubit.qbt文件更新仪器按钮和算法。
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