单一/混合蛋白质分离纯化方法与质谱鉴定详解-百泰派克生物科技......

文章导读

• 单一蛋白质样品的分离、纯化？

• 单一蛋白质的质谱鉴定？

• 蛋白质混合物质谱鉴定方法？

对于单一蛋白的常用鉴定方法，大家肯定立马想到免疫印迹法（Western Blot）。Western Blot是通过抗体和目标分子的特异性结合从而对目标蛋白进行鉴定，这种方法是适用于对已知蛋白进行鉴定，并且必须借助抗体，不适用于对未知或者没有相应抗体的蛋白进行分析。那么小伙伴们可能要问了，如果自己要研究的蛋白质是未知的或者目前没有可用抗体怎么办呢？在这种情况下，就可以借助质谱鉴定技术来对蛋白质进行鉴定了。在这期中小编就给大家整理了蛋白质鉴定的相关知识，希望对于蛋白质鉴定一直有困惑的同学能有帮助。

一、单一蛋白质分离纯化

提到单一蛋白样品，顾名思义在这类蛋白样品应该已经经过了一定的蛋白纯化步骤，获得了相对单一的蛋白。通常通过细胞裂解或者体外合成的蛋白质都包含其他的杂蛋白，需要将目的蛋白与杂蛋白区分开，常用的蛋白分离纯化方法便是电泳分离。一维电泳分离利用蛋白质大小不同的特性，能够很好的将不同分子量的蛋白进行区分，基础之上二维电泳能够进一步将不同带点量的蛋白分子进行区分。

1、一维电泳

目前普遍采用的一维电泳为垂直板聚乙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE胶），其原理是不同浓度的乙烯酰胺在聚合后会产生具有一定孔径大小的凝胶，接着在缓冲液中加入SDS表面活性剂中和蛋白质表面的电荷，当变性的蛋白质混合样品通过凝胶空隙的时候，不同分子量大小的蛋白质在凝胶中迁移的速度不同被分离开来。一维电泳能够分离对大多数蛋白和蛋白质复合物进行初步分离。

2、二维电泳 二维电泳，也称为双向电泳，是在一维电泳的基础上加入了横向的等电聚焦分离，而其纵向的分离与一维SDS分离方法完全一样。二维电泳利用蛋白等电点不同的特性，对蛋白进行初步分离，接着再根据蛋白质分子量不同，再进一步对等电点相同或相近的蛋白质进行二维分离，进一步提升蛋白质分离效率。二维电泳的蛋白分辨率相比一维电泳已经大幅度提升，经过二维电泳分离后大部分蛋白质都能够被分离为含有单一的蛋白质蛋白胶点。

二、单一蛋白质鉴定

目前对纯度较高，或单一蛋白质的鉴定的方法有蛋白质指纹谱鉴定（PMF）和MS/MS串联质谱鉴定法。这两种方法都是先将蛋白质酶切成多肽片段，再利用质谱仪对肽段分析，达到对蛋白质鉴定的目的。而两种方法的不同之处就在于PMF法只使用一级质谱对蛋白肽段进行检测，而MS/MS不仅经过一级质谱检测，并且在此基础上选取特定肽段进行肽段破碎，对肽段的序列进行测定。MS/MS比PMF的鉴定准确度更高，与数据库比对的可靠性更高，但分析起来的也更为复杂。

1、蛋白质指纹谱鉴定（PMF）

由于蛋白质序列的不同，不同的蛋白质在同一种消化酶的作用下酶切产生的多肽片段大小质量是特异的。蛋白质指纹谱鉴定法正是利用了每种蛋白酶切产生的太片段不同的特性，对纯化的蛋白质进行酶切处理，再对酶切产生的肽片段的质量进行分析，即可获得蛋白质的肽质量谱图。再将肽谱图与数据库中蛋白质理论肽谱图进行比对，进而可获知蛋白质的身份信息。

2、MS/MS串联质谱法 串联质谱（MS/MS）检测蛋白的原理是先使用一级质谱检测肽段的质量信息，再选取峰值高的肽段进行破碎，分析获得二级质谱。用检索软件选择相应的数据库对质谱数据进行分析，以打分的形式评判鉴定结果，当打分大于某个阈值时，即判定质谱鉴定成功，则鉴定失败。

三、蛋白混合物鉴定

目前有多种蛋白质分离纯化的方法，但在很多时候分离效率不够高，导致分离后的蛋白可能还是含有多个蛋白。对于丰度较低的蛋白质可能在分离过程中造成进一步损失而无法被鉴定到，需要直接对这一类蛋白质不经过分离处理直接进行分析。目前适用于对混合蛋白进行分析的方法有LC-MS/MS色谱质谱串联分析法。与PMF法和MS/MS法相比，LC-MS/MS在质谱分析前加了液相色谱的分离，使得蛋白分析精度更高，对肽段序列测定几乎可以的达到100％的准确度。与单个蛋白质胶带的鉴定相比，这项服务的可以鉴定的蛋白数量也更多。LC-MS/MS可以用于鉴定200个蛋白质左右的蛋白混合物样品，包括免疫沉淀样品，Pull-down样品等。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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