蛋白糖基化分析完整指南（基于 LC‑MS/MS 的工作流程）......

蛋白质糖基化（Glycosylation）是一种关键的翻译后修饰（PTM），广泛存在于真核生物细胞中，影响蛋白质的折叠、稳定性、细胞定位及其与其他分子的相互作用。在生物制药、癌症生物标志物发现、疫苗研发等领域，糖基化研究正发挥日益重要的作用。与磷酸化、乙酰化等常见PTM相比，糖基化具有结构多样性强、微量分布广和分析难度大的特点。这使得基于质谱（LC‑MS/MS）的蛋白糖基化分析成为当前研究的技术热点，也对数据获取和解读提出更高要求。

一、什么是蛋白糖基化？

蛋白糖基化是指寡糖链通过酶促作用连接到蛋白质的氨基酸残基上，常见类型包括：

• N-糖基化：发生在天冬酰胺（Asn）残基上，通常存在于共识序列 N-X-S/T（X≠P）中；

• O-糖基化：发生在丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）上，结构更加异质、无严格保守序列；

• 罕见糖基化类型：如C-糖基化、糖胺聚糖（GAG）修饰、唾液酸化等。

糖基化修饰的功能与其结构密切相关，研究糖链的连接位点、糖型构成及微异构体（glycoforms）对于理解其生物功能至关重要。

二、LC‑MS/MS 技术在糖基化分析中的优势

LC‑MS/MS（液相色谱-串联质谱）技术是目前解析糖蛋白结构的shǒuxuǎn方法，具有如下优势：

• 高通量检测：可检测上百种糖基化肽段；

• 高分辨率和高灵敏度：可区分糖链微异构体；

• 可定量分析：结合标签（TMT/iTRAQ）或无标记定量方法；

• 可定位修饰位点：利用MS/MS碎片信息推断糖基化位点和糖链结构。

在百泰派克生物科技，我们基于高分辨率Orbitrap质谱平台，结合优化的样本前处理与数据库搜索策略，为科研客户提供高质量的糖基化组学服务，助力深入解析糖修饰对蛋白功能的调控作用。

三、蛋白糖基化LC‑MS/MS分析的完整工作流程

1、样本准备与蛋白提取

样本来源可以是细胞、组织、血清/血浆或重组蛋白。关键在于保持糖基化修饰的完整性，常用缓冲体系需避免强脱糖剂。

蛋白提取后，进行如下步骤：

• 定量（BCA法）

• 变性、还原（DTT）、烷基化（IAA）

• 胰蛋白酶（Trypsin）酶解

提示：糖基化修饰可能阻碍蛋白酶切割效率，可考虑双酶策略（如Trypsin + Glu-C）提升覆盖度。

2、糖肽富集

糖基化肽段在肽池中占比极低，富集是成败关键。主流策略包括：

• HILIC（亲水相互作用色谱）：适用于N/O-糖肽，保留亲水性强的糖肽；

• Lectin亲和色谱：利用凝集素识别特定糖结构；

• TiO₂/IMAC：虽主要用于磷酸化，也可捕获部分酸性糖肽（如唾液酸修饰）；

• Hydrazide chemistry：通过化学氧化捕获N-糖肽；

结合多种富集方法常能提升糖肽覆盖度。

3、LC‑MS/MS 分析参数设定

糖肽通常分子量大、异构体多、碎裂复杂，质谱方法需精心设定：

（1）质谱平台选择：建议采用Orbitrap Exploris、Fusion Lumos等高分辨率质谱；

（2）碎裂模式：

• HCD（高能碰撞裂解）：适用于定量和肽段识别；

• ETD（电子转移裂解）或EThcD：保留糖链结构信息，有利于修饰位点鉴定。

（3）扫描方式：

• DDA（Data-Dependent Acquisition）用于发现研究；

• DIA（Data-Independent Acquisition）适合构建糖基化谱库和大规模定量。

百泰派克生物科技在糖肽优化扫描方法方面积累丰富经验，支持按需定制HCD+ETD组合模式，实现更jīngzhǔn的结构解析。

4、数据解析与糖链结构注释

糖肽数据解析较为复杂，需结合多种工具和数据库：

（1）数据库搜索：

• 搜索引擎如 Byonic、pGlyco、MSFragger-Glyco 可识别糖链组合；

• 支持自定义糖链库，提高鉴定特异性。

（2）糖链注释：

• 基于MS/MS碎片分析糖结构（Y、B离子）；

• 软件如 GlycoWorkbench、GlycoMod 可辅助手动校验。

（3）定量分析：

• 标签定量（TMT/iTRAQ）或Label-free方法均可实现；

• 聚焦同一糖肽不同glycoforms的相对丰度变化。

5、生物信息学与功能注释

完成糖基化位点和糖型注释后，可进一步开展：

• 功能富集分析：GO/KEGG通路挖掘受糖基化调控的关键生物过程；

• 疾病关联分析：如癌症中糖链唾液酸化、分支度变化；

• 蛋白结构建模：模拟糖链对蛋白空间构象的影响。

百泰派克生物科技提供全流程生物信息学支持，帮助研究者从复杂糖基化数据中提取具有生物学意义的信息。

四、常见挑战与优化建议

五、应用场景：从基础研究到生物制药

随着高分辨质谱和生物信息学工具的进步，蛋白糖基化分析正变得更系统、更jīngzhǔn。无论是基础科研还是生物医药开发，对糖基化修饰的深入理解都将为生命科学探索开辟新路径。百泰派克生物科技致力于为研究者提供高覆盖度、高灵敏度的糖基化组学服务，覆盖从样本制备、富集、LC-MS/MS检测到生信分析的完整流程，助力客户实现从数据到发现的跨越。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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