二硫键在蛋白中的形成、功能与分析方法

在生命分子的精密构造中，二硫键（Disulfide bond）是一种常被忽视却至关重要的化学连接。它由两个半胱氨酸残基之间的硫原子形成，可显著增强蛋白质的空间稳定性与功能耐受性。特别是在分泌蛋白、抗体药物、生物酶等关键分子中，二硫键往往是其正确折叠与功能执行的“分子锁”。本文将系统介绍蛋白质中二硫键的形成机制、生物学功能以及现代分析方法，并结合百泰派克生物科技在结构质谱领域的优势，探讨如何高效开展二硫键相关研究。

二硫键的形成机制

1、半胱氨酸残基

二硫键形成于两个半胱氨酸（Cysteine，Cys）残基之间的巯基（–SH），在氧化条件下两者脱氢形成共价连接的 –S–S– 键。

反应示意如下：

R–SH + R'–SH → R–S–S–R' + 2H⁺ + 2e⁻

该反应多发生在内质网或过氧化物酶体等氧化性环境中，而细胞质中因还原环境（如谷胱甘肽存在）不利于稳定二硫键。

2、二硫键的形成受多个因素调控

（1）序列依赖性：蛋白质中Cys的空间位置决定其是否可形成有效二硫键

（2）酶促辅助：如蛋白二硫异构酶（PDI）可协助二硫键形成与重排

（3）翻译后加工：伴随蛋白折叠逐步建立稳定构象

二硫键在蛋白质中的功能

1、稳定蛋白质三维结构

二硫键通过连接多肽链中相距较远的区域，减少了自由构象空间，是维持蛋白质稳定构象的重要手段。尤其在极端pH、温度条件下，这种共价连接比氢键更稳定。

2、参与功能调控与信号传导

某些蛋白中，可逆性二硫键作为分子开关，参与氧化还原调节机制。这些蛋白在氧化压力下形成临时二硫键，用于调控自身或他人的功能状态，参与抗氧化应激、信号转导、细胞凋亡等过程。

3、保证蛋白正确折叠

在重组蛋白表达中，二硫键的正确配对直接决定了蛋白能否获得天然构象。错误配对可能导致：

（1）蛋白聚集、包涵体形成

（2）功能丧失或错误激活

（3）降低表达纯度与质量

蛋白二硫键的分析方法

为了验证蛋白是否正确折叠、是否存在错误配对，现代结构生物学借助质谱、突变、色谱等技术，实现二硫键的jīngzhǔn分析。

1、方法一： 还原/非还原质谱比较法

通过比较蛋白在还原（如DTT、TCEP处理）与非还原条件下的质谱肽图差异，推测存在的二硫键。

（1）实验流程

• 蛋白非还原/还原双组处理

• 酶解（如Trypsin）

• LC-MS/MS分析

• 鉴定跨肽段连接信号，即为二硫键

（2）优点

• 操作简单，适用于常规检测

• 可判断是否存在二硫键以及其大致位置

（3）缺点

• 难以jīngquè定位连接的Cys残基

• 高复杂蛋白中解析困难

2、方法二： ETD/ECDgāojí碎裂质谱法

ETD（电子转移解离）或 ECD（电子俘获解离）在不破坏二硫键的前提下断裂多肽主链，从而jīngzhǔn定位形成二硫键的两个Cys残基。

（1）特点

• 可在非还原状态下识别真实构象中的二硫键

• 精度高，适用于复杂抗体、酶、结构蛋白分析

（2）应用平台

• Orbitrap Fusion

• Exploris 480（百泰派克生物科技配备）

3、方法三：定点突变验证法（Cys → Ser）

通过对Cys残基突变为Ser，逐一验证是否参与关键二硫键构象。常用于结构研究、功能验证。

（1）优点：能从功能上验证某个Cys是否重要

（2）局限：实验周期长，适合深入研究而非高通量分析

4、方法四：Top-Down 整蛋白质谱分析

不进行酶解，直接上机分析完整蛋白及其碎裂模式，适合蛋白构象完整性检测。可结合高分辨ETD碎裂，识别蛋白天然构象下的二硫连接。

百泰派克生物科技二硫键分析

百泰派克生物科技基于多年蛋白质组与结构质谱经验，提供全面、jīngzhǔn、高分辨的二硫键分析解决方案：

服务亮点：

（1）高灵敏度Orbitrap平台，支持ETD碎裂，原位识别二硫键

（2）定制化酶解策略，提升跨肽段识别率

（3）zhuānyè数据解析团队，使用Byonic、pLink、Prosight等软件确保结果可信

（4）项目全流程咨询，协助从实验设计到结果解读

二硫键作为维持蛋白质结构稳定与功能调控的关键桥梁，其形成与分析是生物化学与蛋白质工程领域的重要命题。借助高端质谱技术与zhuānyè服务平台，研究人员能够更全面地理解蛋白质构象、提升重组蛋白表达效率，并推动抗体药物等生物制剂的高质量开发。

百泰派克生物科技特色项目

蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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