磷酸化定量蛋白质组学的核心原理和实验流程

磷酸化是zuì常见且功能zuì复杂的翻译后修饰之一，在细胞信号传导、代谢调控和疾病机制中扮演核心角色。磷酸化定量蛋白质组学（phosphoproteomics）的核心原理，是通过质谱技术结合特异性富集方法，系统性地识别和定量蛋白质的磷酸化修饰位点，从而解析信号通路的动态变化和分子机制。随着质谱技术和富集策略的快速发展，磷酸化定量蛋白质组学已成为系统性研究信号通路动态变化的强大工具。本文将深入解析磷酸化定量蛋白质组学的核心原理和实验流程，帮助科研人员系统理解其技术要点与应用前景。

一、磷酸化定量蛋白质组学定义

蛋白质磷酸化是一种可逆的翻译后修饰（PTM），主要发生在丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上。它在调控信号通路、细胞周期、代谢调节等方面扮演核心角色。磷酸化蛋白质组学通过高分辨率质谱，对磷酸化位点进行大规模、定量检测和动态监测，是解析信号转导网络的“放大镜”。

二、磷酸化定量蛋白质组学核心原理

1、 特异性富集低丰度磷酸化肽段

由于磷酸化肽在复杂样本中的丰度极低，富集是实现高灵敏度检测的前提。常用策略包括：

① 金属氧化物亲和色谱（MOAC）：如TiO₂、ZrO₂选择性结合磷酸基团；

② 金属离子亲和层析（IMAC）：使用Fe³⁺或Ga³⁺离子富集带负电的磷酸肽；

③ 抗磷酸化抗体富集：特别适用于Tyr磷酸化位点的捕获。

2、 高分辨质谱分析与数据采集

利用Orbitrap、Q-TOF等高分辨质谱仪，结合数据依赖采集（DDA）或数据独立采集（DIA）技术，对磷酸肽进行jīngzhǔn的质量/电荷比（m/z）测量和定量。

3、 定量策略

① 标记法：如TMT/iTRAQ实现多样本同步定量；

② 无标记法（Label-Free）：基于峰面积积分或谱图计数实现相对定量；

③ SILAC：适用于细胞样本的稳定同位素代谢标记。

三、磷酸化定量蛋白质组学实验流程概览

1、 样本制备

① 细胞/组织裂解，提取总蛋白；

② 蛋白质定量与质量评估；

③ 胃蛋白酶（Trypsin）酶解为肽段。

2、 磷酸化肽段富集

① 采用TiO₂或Fe³⁺-IMAC进行选择性磷酸肽富集；

② 去除非特异性结合肽，优化洗脱条件提高特异性。

3、 质谱分析

① LC-MS/MS分析，获取高分辨谱图；

② 根据研究需求选择DDA或DIA模式；

③ 结合TMT或Label-Free方法进行定量。

4、 数据分析

① 使用MaxQuant、Spectronaut、Proteome Discoverer等软件进行肽段识别与定量；

② 磷酸化位点定位（Localisation Probability）；

③ 下游功能注释与通路富集（如KEGG、GO）分析。

四、磷酸化定量蛋白质组学应用前景与典型案例

1、肿瘤信号通路解析：识别关键激酶磷酸化活性，辅助靶点筛选；

2、药物作用机制研究：评估抑制剂对下游磷酸化事件的影响；

3、 时间序列分析：动态监控细胞响应过程中的磷酸化网络变化。

磷酸化定量蛋白质组学以其高通量、高灵敏度、定量化的优势，已成为探索生命活动本质的重要手段。在百泰派克生物科技，我们整合先进的Orbitrap Exploris 480质谱平台与自主优化的磷酸肽富集方案，可实现：高灵敏度检测低丰度磷酸化位点；jīngzhǔn定量多样本间磷酸化变化；支持复杂样本（如FFPE组织、临床液体活检）的高通量分析；提供从样本处理到生信分析的一站式服务。您将获得一站式、定制化的磷酸化组学解决方案，助力科研成果的快速产出与jīngzhǔn突破。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.zhuānyè生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，zuì后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标进行表征，百泰派克生物科技可做到检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从zuì小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等zhuānyè服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，zhuānyè提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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