蛋白质磷酸化修饰类别、富集和鉴定方法

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导读

• 蛋白质磷酸化修饰定义？

• 蛋白质磷酸化修饰类别？

• 蛋白质磷酸化鉴定方法有哪些？

• 蛋白质磷酸化肽段富集方法？

在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰，在脊椎动物基因中，约有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸酶。它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程，一直是生物学研究的重点与热点。

1-. 蛋白质磷酸化

蛋白磷酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的磷酸基团（P04）转移到不同种类的氨基酸上（主要包括丝氨酸S、苏氨酸T、酪氨酸Y），从而使蛋白质发生翻译后修饰的过程。

图1. 蛋白质磷酸化修饰反应

2. 磷酸化修饰类型

根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4类，即O-磷酸盐蛋白质、N-磷酸盐蛋白质、酰基磷酸盐蛋白质和S-磷酸盐蛋白质。

• O-磷酸盐蛋白质通过羟氨基酸（如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）的磷酸化形成

• N-磷酸盐蛋白质通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成

• 酰基磷酸盐蛋白质通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成

• S-磷酸盐蛋白质通过半胱氨酸磷酸化形成

到这里，不得不提起如何鉴定磷酸化蛋白的修饰位点以及类别？

3. 蛋白质磷酸化修饰鉴定方法

1-. Western Blotting

免疫印迹技术是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的、根据特定抗原-抗体的特异性反应来检测复杂样品中的某种蛋白质的免疫生化分析方法。

技术优势特点

• 检测特异性高

• 能够特异鉴定单个磷酸化位点

• 磷酸化鉴定受磷酸化抗体限制，高效特异性的磷酸化抗体制备较难；新发现的磷酸化位点往往缺乏有效的磷酸化检测抗体

2. 同位素标记（Isotope Labeled）结合免疫印迹法

此方法的原理是当蛋白发生磷酸化时，放射性32P的掺入和分子质量变化引起的凝胶迁移（gelshift），再通过免疫印迹方法检测同位素标记，从而达到鉴定磷酸化蛋白的目的。

技术优势特点

• 检测技术灵敏并且直观

• 常用于体外磷酸化反应结果检测

• 磷酸化鉴定不受抗体限制

• 可分析多个蛋白磷酸化

3. Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

Mn2+-Phos-tagSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳通过连接在丙烯酰胺分子上的双核金属（如Mn2+）配合物对磷酸基团的亲和，造成磷酸化蛋白迁移的滞留，再将电泳结果转移到PVDF膜上，用相应蛋白的抗体识别，根据迁移滞留检测蛋白磷酸化。

图2. 丙烯酰胺铰链Phos-tag作用原理

技术优势特点

• 无放射危害

• 鉴定不受限于特异性识别蛋白质磷酸化的抗体

• 适用于大规模磷酸化蛋白分析

• 与质谱鉴定兼容，进行更为精细的分析鉴定

4. 质谱鉴定法

在质谱分析中，先使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，生成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，在磁场的作用下，质荷比相同的离子会被聚焦到同一点上，不同质荷比的离子聚焦于不同点上，获得区分不同质荷比离子的质谱图。与未经修饰的肽段相比，磷酸基团修饰的肽段在相对分子质量上就会增加79.983，由此在质谱图中能够与未修饰肽段进行区分。

图4. TiO2富集磷酸化肽段原理

固相金属亲和色谱IMAC

固相金属离子亲和色谱利用的是磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力,可有效吸附磷酸化基团，从而达到富集磷酸化肽段的效果。鳌合底物上的金属离子通常是Fe3+或Ga3+，可以选择性地与磷酸化肽中的磷酸部分相结合,并且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。这个方法不能够有效富集不与IMAC结合的磷酸化肽段。

pY-1000基序抗体富集

高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白，选择性分离磷酸化蛋白。其中，酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知的较好的检测磷酸化蛋白质的抗体，它具有较强的亲和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。并且酪氨酸磷酸化的相对比例极低，只占磷酸组的1%，但在肿瘤领域和细胞信号转导方向却是重中之重。用上述TiO2和IMAC方法很难富集到，目前利用基序抗体在肽段水平上免疫富集酪氨酸磷酸化是分析此磷酸化的s_h_ǒ_u|选方法。

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