蛋白质质谱分析常用的酶，即在进入质谱仪分析之前用于消化蛋白质使其成为较短的肽段时常有的酶。在质谱分析中，一般含有6至20个氨基酸残基的肽段更适合质谱分析和数据库的比较。在蛋白质组质谱分析中常用于消化蛋白质的酶包括胰蛋白酶和Glu-C。
胰蛋白酶
胰蛋白酶，是一种丝氨酸蛋白酶，是蛋白质质谱分析实验中使用Z_U_I广泛的一种酶。胰蛋白酶可以将蛋白质切割成平均大小为700至1500道尔顿的肽，这是质谱检测的理想范围。胰蛋白酶具有高度的特异性，在精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧进行切割，但当精氨酸或赖氨酸的C端存在脯氨酸时不能进行切割。此外，胰蛋白酶具有很高的蛋白水解活性，在宽pH值和温度范围均可工作并能耐受许多添加剂。在鸟枪法蛋白质组学中，胰蛋白酶已经成为蛋白质消化的黄金标准。
Glu-C
Glu-C即V8蛋白酶，是一种内切蛋白酶，在乙酸铵或碳酸氢铵缓冲液中可切割谷氨酸残基的羧基端，在磷酸钠缓冲液中则切割谷氨酸和天冬氨酸残基。相比之下，Glu-C有着与胰蛋白酶不同的切割专一性，可以用于分析蛋白质中赖氨酸和精氨酸含量高的区域。
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